南京off-target脱靶检测评估标准

gRNA的长度和错配： 17个核苷酸长度的gRNA显示出更高的基因组编辑效率。相比之下，18-20 bp的长度显示出较低的基因组编辑效率。在人类细胞中减少潜在脱靶效应的指导方针：1) 应避免在PAM的7-10 bp范围内靶序列有超过3个错配；2) 在PAM的12 bp内，应避免sgRNA 凸起以减少脱靶效应。gRNA的化学修饰：在gRNA核糖磷酸骨架中加入2ʹ-O-甲基-3ʹ-膦酰基乙酸酯会导致位点特异性修饰，使脱靶切割减少40-120倍，同时保持靶向性能。gRNA上游5'发夹结构的修饰可以提高Cas9和Cas12的特异性，降低脱靶效应。定量脱靶检测，推荐唯可生物，实验实力强，专业性高，检测效率高，结果准确率高。南京off-target脱靶检测评估标准

检测方法的敏感度、特异性和可重复性应经过验证，并设计适当的阳性和阴性对照；当体内靶细胞或替代细胞中载体序列阳性的比例超出预期范围时，应开展克隆性生长的评估。如果存在优势克隆或单克隆生长，应在不超过3个月的时间内再次检测确认，并尽快开展整合位点的分析。当载体的整合位点确定后，应与人类基因组数据库及基因组的其他数据库等进行比较，确定整合位点的基因功能，评估是否与包括zheng在内的任何疾病有关。如果受试者体内出现载体阳性细胞的克隆性生长，或检测发现基因整合位点在基因或相关基因附近，应缩短检测间隔至不超过3个月并密切监测恶性liu征兆，直至检测不到基因zhiliao载体。杭州定量脱靶检测技术选择潜在的脱靶位点，例如选择gRNA预测网站上Top 5潜在脱靶位点，进行Sanger测序单克隆；

改进Cas变体使用SpCas9和SaCas9 变体：已研发出诸如SpCas9-Nickase、dCas9 、dCas9–FokI、xCas9、Cas9-NG、evoCas9、SpCas9 – HFI、eSpCas9和Hypa-Cas9等多种Cas变体，可降低脱靶效应。改进的Cas9同源物具有更广的PAM功能和特异性：实验表明Cpf1、CRISPR-Cpf1-RNP可降低脱靶效应。CRISPR 递送方法：基于病毒的递送方法：腺病毒 (AdV) 显示出整合到靶细胞基因组中的微弱潜力，这一特征有利于限制脱靶效应。然而，AdVs 会引发免疫反应，目前还不能完全排除它与宿主基因组整合的可能性。非病毒递送方法：当sgRNA和Cas9以RNP复合物形式传递时，电穿孔显示植物原生质体中的脱靶突变数量很低。通过脂质体介导的转染传递RNP复合物显示，与质粒DNA转染相比，脱靶突变的发生率较小。

CRISPR/Cas系统是细菌和古细菌在不断进化的过程中产生的适应性免疫防御机制，它应用CRISPR RNA（crRNA）以碱基互补的形式引导相应的Cas蛋白识别入侵的外源基因组，并对其DNA进行剪切，用以保护自身的基因组免受外源核酸如噬菌体、病毒等的干扰和破坏。经过人为改造后，可在真核细胞中实现高度灵活且特异的基因组编辑，通过设计特异性向导RNA(Single guide RNA, sgRNA)序列与靶序列进行碱基配对，从而引导Cas蛋白结合到靶序列处，行使DNA切割功能，然后利用细胞的非同源性末端连接(Non-homologous end joining, NHEJ)或同源重组(Homologous recombination,HR)修复机制对断裂的DNA进行插入缺失(Indel)、修复(Repair)或替换(Replacement)。由于其相对于锌指核酸酶(ZFNs)和转录jihuo因子样效应物核酸酶(TALENs)技术更易于操作，而且更高效，因而被广运用于对基因组特定位点进行靶向编辑。针对已经获得的有切割能力的sgRNA，需要进一步明确其体内脱靶效应。

国内外基因zhiliao产品开展的非临床研究、长期随访获得的临床经验以及基因组整合位点分析方法的明显改进，都有助于更好地理解整合性基因zhiliao载体相关风险。通常认为，很多能够介导外源基因转入细胞核的载体（如逆转录病毒载体、转座子元件和基因编辑产品等）有基因组整合潜力，需要通过长期随访观察迟发性不良反应的风险；根据目前的认识和研究数据，质粒、痘病毒、腺病毒和腺相关病毒（AAV）等载体的基因zhiliao产品整合风险较低，国际上开展的临床试验中也表现出较低的迟发性不良反应风险。当载体或基因zhiliao产品原有的风险特征增加时，例如经过修饰以携带基因组编辑成分的质粒或改变给yaofang式以提高整合能力等，需要提高对长期随访观察的要求；反之，也可以对目前认为存在迟发风险的基因zhiliao载体进行修饰，以降低这些风险。根据选择的sgRNA，通过生物信息学方法，对sgRNA进行脱靶分析。深圳crispr/cas9脱靶检测guide-sequence

随着脱靶影响因素、降低策略及脱靶检测技术研究的不断深入，未来CRISPR/Cas9系统将在更多领域造福人类。南京off-target脱靶检测评估标准

以上长期随访时间的建议主要基于基因zhiliao的产品类型，具体产品的随访时间取决于产品的特性和体内存在时间、转基因表达时间、迟发性不良反应的预期时间及发生率、受试者适应症和预期生存期、给药途径、以及长期随访的其他观察目的。随着随访数据的积累，研究者和研究申办方可能会根据产品的存在情况、转基因表达和临床表现的持续评估情况，延长或缩短长期随访的持续时间。如果研究申办方认为其基因zhiliao产品安全性风险较低、无需开展长期随访临床研究，或者希望变更随访时间，应合理说明依据或变更理由并与药品监督管理部门进行沟通。南京off-target脱靶检测评估标准