外泌体表征与定量难在什么地方?又该怎么做?我们拜访过很多外泌体研究工作者,其中谈到多的是外泌体难以分离,分离后的外泌体不好定量,定量的外泌体数据是否准确等问题。很多人认为外泌体的分离难点在于样本差异、杂质类型或外泌体来源于细胞等,但业内人事认为,外泌体的分离之难,在于没有很好的方法去判定外泌体的纯度和活性。本文从外泌体定量和表征的角度来分析,什么样的外泌体才是高质量的,以及如何对外泌体进行计数。单一定量和表征方法的局限性对外泌体的鉴定方法,目前行业内基本上是一致的:通过形态、粒径范围、标志蛋白等定性检测。1.单一定量方法的局限性对外泌体的定量,使用较多的还是颗粒数。众所周知,外泌体被定义为30-150nm的小细胞外囊泡,比较大和小的外泌体表面积相差25倍、体积相差125倍。而外泌体发挥功能主要依赖其所载货物,比较大和小外泌体对受体细胞的效应也会有较大差异。同时颗粒数的检测方法包括NTA或纳米流式等,并不能分辨外泌体和其他具有相识粒径的其他杂质,在计算颗粒数时,不同纯度外泌体数据的可参考性也并不相同。所以通过颗粒数来对外泌体定量,可能有其局限性。外泌体研究工具稳定批次生产,确保实验重复性,降低结果波动风险。高效Exosome应用研究

外泌体研究常见问题解答145.外泌体RT-qPCR实验是选择哪个靶标作为内参?外泌体没有公认内参,理由如上。常规内参基因在外泌体中表达量甚至可能比目标基因还低。外参是在没有合适内参的情况下的替代物。miRNA检测外参是化学合成的线虫短片段单链RNA(cel-miR-39-3p)在人、小鼠、大鼠中均无同源片段,比较大限度降低了对定量实验造成的干扰。6.外泌体SmallRNA-seq实验,样本量有什么要求?肿瘤细胞系推荐使用40mL以上的初始样品量。某些细胞(如悬浮细胞、干细胞、神经细胞等)中外泌体含量比较低,建议使用100mL的初始样品量。一般需提取到10ng以上的TotalRNA,才可以用于SmallRNA-seq实验。7.如何确保外泌体RT-qPCR和SmallRNA-seq实验的成功率?为了保证转录组实验的成功率,建议对提取的外泌体RNA进行质控,确保RNA质量。如检测RNA的浓度、纯度和片段分布等,但由于外泌体RNA含量较低,建议使用商业的外泌体RNA质控试剂盒对RNA质量进行评估。实验室外泌体冻干外泌体研究工具标准化质量检测,每批次严格质控,保障实验可靠性。

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