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将浓缩液加至20mmol/LTris/30%蔗糖/45%蔗糖(pH7.4)的密度梯度液上行4℃超速离心100000×g(水平转子SW-41)8h,吸取位于蔗糖之上的颜色明显较深条带的液体约5mL,以10倍PBS稀释混匀后再次用100-ku超滤离心管(Millipore)浓缩至5mL,将浓缩液重新以10倍PBS稀释后4℃超速离心100000×g(角转子TYPE50.2)4h,收集离心管底部约1mL液体及极微量沉淀(来自2×107个细胞)以20mLPBS重悬即为胞外体,用0.22μm过滤膜除菌后冻存于-80℃备用。（该步骤参考文献“肿瘤细胞来源胞外体的分离鉴定与功能检测”）优点是：分离得到的外泌体纯度很高。缺点是：步骤繁琐、耗时耗力、对离心时不好把握。静置10～15分钟，留取沉淀物备用。济南外泌体提取试剂服务电话

外泌体鉴定：外泌体分离之后，需要经过一系列鉴定才能确定分离的是外泌体。鉴定方法从物理特征到表面分子标志物，多角度进行鉴定。l透射电镜鉴定法：简称TEM，适合外泌体双层囊膜超微结构观察，即通常为茶托型或一侧凹陷的半球形。l纳米颗粒追踪分析法：简称NTA，该方法能保证外泌体原始状态、检测速度快，检测后能提供外泌体粒径和浓度信息。lWesternblot分子标志物检测：外泌体标志蛋白包括四跨膜蛋白家族，如CD9、CD63和CD81；细胞质蛋白，如肌动蛋白（Actin）和钙磷脂结合蛋白（Annexins）；金华外泌体提取试剂单价外泌体的提取方法，先用含无外泌体血清的培养基对人脂肪来源间充质干细胞进行饥饿培养。

外泌体在肺病进程中的作用：在一些病症微环境中，一些病症细胞来源的外泌体能够诱导CD4+T分化为调节性T细胞，压制机体的抗一些病症免疫反应；肺病细胞分泌的外泌体含有miR-21和miR-29a，可在免疫细胞中结合并启动TLR8，使TLR介导的NF-κB信号通路活化，从而导致一些病症的生长和转移。在肺病的侵袭和转移过程中，细胞间通讯扮演着重要的角色。据有关报道称，NSCLC分泌的外泌体内TGFβ和IL10的高表达与肺病的转移密切相关。此外，启动的T细胞可以通过调控Fas信号通路增加基质金属蛋白酶9（MMP9）的表达，进而促进肺病的转移。这些机制有望成为肺病治病的潜在靶点。虽然大多数外泌体都是促进一些病症的侵袭与转移，但也有报道称，外泌体miR-302b可以通过压制TGFβRⅡ来压制肺病细胞的转移与增殖。如纯度和回收率低，杂蛋白较多（假阳性），颗粒大小不均一，产生难以去除的聚合物

外泌体的提取方法：1、磁珠免疫法。外泌体表面有其特异性标记物（如CD63、CD9蛋白），用包被抗标记物抗体的磁珠与外泌体囊泡孵育后结合，即可将外泌体吸附并分离出来。磁珠法具有特异性高、操作简便、不影响外泌体形态完整等优点，但是效率低，外泌体生物活性易受pH和盐浓度影响，不利于下游实验，难以普遍普及。2、多聚物沉淀法。聚乙二醇（PEG）为常用的多聚物，可与疏水性蛋白和脂质分子结合共沉淀，早先应用于从血清等样本中收集病毒，现在也被用来沉淀外泌体，其原理可能与竞争性结合游离水分子有关。利用PEG沉淀外泌体存在不少问题：比如纯度和回收率低，杂蛋白较多（假阳性），颗粒大小不均一，产生难以去除的聚合物，机械力或者吐温-20等化学添加物将会破坏外泌体等。外泌体提取：用于聚合物沉淀的较常见聚合物之一是聚乙二醇（PEG）。

外泌体（exosomes）是活细胞经过"内吞-融合-外排"等一系列调控过程而形成的膜性囊泡，来源于晚期核内体(也称为多囊泡体)，直径约为30-150nm，密度在1.13-1.21g/ml，天然存在于血液、唾液、尿液及母乳等体液中，同时外泌体也存在于组织和细胞间隙中。人体中几乎所有类型的细胞均能产生外泌体，人体中大约有1014个外泌体，大约平均每个细胞产生1000-10000个。外泌体中含有核酸（DNA、miRNA、lncRNA、mRNA、tRF等）、蛋白和脂类，在细胞间物质和信息转导中发挥重要作用，研究表明其在干细胞、免疫调控、瘤转移、血管生成以及生物标志物等领域都发挥着不可替代的作用。直接把外泌体从尿液中沉降下来，无须分离培养人尿液来源细胞并收集培养基。杭州正规外泌体提取试剂直销价

外泌体提取：超滤膜也可用于分离外泌体。济南外泌体提取试剂服务电话

外泌体的提取方法，先用含无外泌体血清的培养基对人脂肪来源间充质干细胞进行饥饿培养，这样可使干细胞处于正常生长状态，不会被克制生长增殖，其所分泌的外泌体所包含的有效物质也更贴近其自然状态下的外泌体，然后将含有外泌体的培养上清液进行低速差速离心(即先一离心处理、再第二离心处理)以去除细胞及其碎片，用100kd超滤管对低速差速离心后的离心液进行超滤浓缩得到外泌体浓度更高的超滤液，将超滤液经过第三离心处理去除杂质后直接用0.22μm过滤器过滤除菌，过滤掉粒径为220nm以上的物质，进一步得到含颗粒粒径小于220nm的浓缩液，因超滤浓缩处理和第三离心处理使得液体量浓缩，这样过滤除菌效率得到较大提高，较后将浓缩液进行超速离心的第四离心处理分离提取到外泌体。该外泌体的提取方法，既结合了差速离心，又结合了超滤和超速离心，通过该提取流程，较终可高效地从人脂肪来源间充质干细培养上清液中提取到高浓度、高纯度的外泌体，具有操作简单、成本低，适合产业化生产的特点。济南外泌体提取试剂服务电话

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