对于双光子成像而言，离焦和近表面荧光激发是两个比较大的深度限制因素，而对于三光子成像这两个问题大大减小，但是三光子成像由于荧光团的吸收截面比2P要小得多，所以需要更高数量级的脉冲能量才能获得与2P激发的相同强度的荧光信号。功能性3P显微镜比结构性3P显微镜的要求更高，它需要更快速的扫描，以便及时采样神经元活动；需要更高的脉冲能量，以便在每个像素停留时间内收集足够的信号。复杂的行为通常涉及到大型的大脑神经网络，该网络既具有局部的连接又具有远程的连接。要想将神经元活动与行为联系起来，需要同时监控非常庞大且分布普遍的神经元的活动，大脑中的神经网络会在几十毫秒内处理传入的刺激，要想了解这种快速的神经元动力学，就需要MPM具备对神经元进行快速成像的能力。快速MPM方法可分为单束扫描技术和多束扫描技术。全球多光子显微镜主要厂商基本情况介绍，包括公司简介、多光子显微镜产品型号、产量、产值及动态等。美国全自动多光子显微镜焦点激发
多光子显微优点：☆光损伤小：由于双光子显微镜使用的是可见光或近红外光作为激发光源，这一波段的光对细胞和组织的光损伤小，适用于长时间的研究；☆穿透能力强：相对于紫外光，可见光和近红外光都具有更强的穿透能力，因而受生物组织散射的影响更小，解决对生物组织中深层物质的层析成像研究问题；☆高分辨率：由于双光子吸收截面很小，只有在焦平面很小的区域内可以激发出荧光，双光子吸收*局限于焦点处的体积约为波长3次方的范围内；☆漂白区域小：由于激发只存在于交点处，所以焦点以外的区域都不会发生光漂白现象；☆荧光收集率高：与共聚焦成像相比，双光子成像不需要光学滤波器，这样就提高了对荧光的收集率，而收集率的提高直接导致图像对比度的提高；☆图像对比度高：由于荧光波长小于入射波长，因而瑞利散射产生的背景噪声只有单光子激发时的1/16，降低了散射的干扰；☆光子跃迁具有很强的选择激发性，所以可以对生物组织中一些特殊物质进行成像研究；☆避免组织自发荧光的干扰，获得较强的样品荧光：生物组织中的自发荧光物质的激发波长一般在350~560nm范围内，采用近红外或红外波段的激光作为光源，能**降低生物组织对激发光吸收。美国模块化多光子显微镜技术多光子显微镜能提供多种对比度机制。
Ca2+是重要的第二信使，对于调节细胞的生理反应具有重要的作用，开发和利用双光子荧光显微成像技术对Ca2+荧光信号进行观测，可以从某些方面对有机体或细胞的变化机制进行分析，具有重要的意义。利用双光子荧光显微成像技术可以观察细胞内用荧光探针标记的Ca2*的时间和空间的荧光图像的变化，还可以观察细胞某一层面或局部的（Ca2+）荧光图像和变化。通过对单细胞的研究发现，Ca2+不仅在细胞局部区域间的分布是不均匀的，而且细胞内各局部区域的不同深度或层次间也存在不同程度的Ca2+梯差即所谓的空间Ca2梯差。
现代分子生物学技术的迅速发展和科技的进步，特别是随着后基因组时代的到来，人们已经能够根据需要建立各种细胞模型，为在体研究基因表达规律、分子间的相互作用、细胞的增殖、细胞信号转导、诱导分化、细胞凋亡以及新的血管生成等提供了良好的生物学条件。然而，尽管人们利用现有的分子生物学方法，已经对基因表达和蛋白质之间的相互作用进行了深入、细致的研究，但仍然不能实现对蛋白质和基因活动的实时、动态监测。在细胞的生理过程中，基因、尤其是蛋白质的表达、修饰和相万作用往往发生可逆的、动态的变化。目前的分子生物学方法还不能捕获到蛋白质和基因的这些变化，但获取这些信息对与研究基因的表达和蛋白质之间的相互作用又至关重要。因此，发展能用于、动态、实时、连续监测蛋白质和基因活动的方法是非常有必要的。多光子显微镜的大多数补偿器都采用棱镜。
多光子显微镜因拥有较深的成像深度，和较高的对比度在生物成像中有着重要的意义，但是它通常需要较高的功率。结合时间上展开的超短脉冲可以实现超快的扫描速度和较深的成像深度，但是其本身所利用的近红外波段的光会导致分辨率较低。清华大学陈宏伟教授和北京大学席鹏研究员合作研究，结合了结构光成像和上转化粒子，开发了一种基于多光子上转化材料和时间编码结构光显微镜的高速超分辨成像系统(MUTE-SIM)。它可以实现50MHz的超高的扫描速度，并突破了衍射极限，实现了超分辨成像。相较于普通的荧光显微镜，该显微镜提升了，并且只需要较低的激发功率。这种超快、低功率、多光子的超分辨技术，在分辨率高的生物深层组织成像上有着长远的应用前景。多光子显微镜涉及医学、生物学、化学、物理学、电子学、工程学等学科，生产工艺相对复杂，进入门槛较高。美国全自动多光子显微镜焦点激发
多光子显微镜可以进行深层成像，且具有三维成像的能力，可以应用于拍摄不透明的厚样品。美国全自动多光子显微镜焦点激发
多光子激发的特点。激发波长∶两个或多个光子同时激发，激发波长是单光子激发波长的两倍或多倍（i.e.红光能激发UV探针）。多光子激发∶依赖于多个光子同时到达的时间。使用脉冲飞秒激光器（i.e.10-16seconds），且能提供更高的峰值功率。荧光限制在焦点处，能满足多个光子同时达到产生多光子吸收。荧光强度正比于（激光强度）n。为什么使用飞秒激光器?多光子激发需要超快的激光器，皮秒脉冲不能实现三光子激发。深度成像需要更高、更窄脉冲输出功率。多光子激发光源处于近红外区，对细胞毒性和光漂白更小。美国全自动多光子显微镜焦点激发
