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免疫荧光注意事项：对照实验的设置：1、内源性组织背景对照：某些细胞和组织可能有固有的生物学性质，会产生背景荧光，对结果产生影响，例如色素脂褐质。因此在孵育一抗前，应对样品进行观察，确保抗原本身没有信号。2、阳性对照：用确认含有待测抗原的组织或细胞，与待测标本进行统一处理，结果应为阳性，可证明待测抗原有一定活性并且实验过程中用的试剂及方法均可靠。3、阴性对照：与阳性对照相反，用明确不含有待测抗原的细胞或组织切片染色，结果若为阴性，可排除染色过程中由于非特异性染色造成的假阳性结果。免疫荧光技术可以用于研究细胞内蛋白质的定位和表达水平。mpo免疫组化

细胞免疫荧光简单实验步骤如下：1. 漂洗血清蛋白H7、2-7、4 37度 PBS 2小时。2. -20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟。3. PBS洗净：3min×3。4. 1%Triton：25 min~30 min、配成50 ultriton+5 mlpBS。5. PBS洗净：2×5 min。6. 羊血清封闭：37度，20分钟。7. 一抗，4度过夜，一般要大于18小时或者37度，1-2小时。8. 4度PBS洗净，3 min×5次。9. 二抗37度小于一小时。10. 37度 PBS洗净，3×5 min。11. 凉干封片（封闭液PH8.5）；不管采用何种方法，在使用PBS缓冲液漂洗时，都要漂洗干净并且要测下pH值，可以使用PBS多清洗几次，也可以延长PBS清洗时间，如果结果背景较高可以延长漂洗的次数和时。collagen3免疫抗体免疫荧光技术通过荧光信号的观察来确定抗原或抗体的分布和定位。

其他荧光物质：1．酶作用后产生荧光的物质某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。例如4-甲基伞酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基伞酮，后者可发出荧光，激发光波长为360nm，发射光波长为450nm。其他如碱性酸酶的底物4-甲基伞酮磷酸盐和辣根过氧化物酶的底物对羟基乙酸等。2．镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕（Eu3+）、铽（Tb3+）、铈（Ce3+）等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光，其中以Eu3+应用较广。Eu3+螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，较适合用于分辨荧光免疫测定。所需要的仪器：荧光显微镜、显微荧光分光光度计、流式细胞仪和时间分辨荧光计等仪器激光共聚焦显微镜。

荧光的猝灭：荧光分子的辐射能力在受到激发光较长时间的照射后会减弱甚至猝灭，这是由于激发态分子的电子不能回复到基态，所吸收的能量无法以荧光的形式发射。一些化合物有天然的荧光猝灭作用而被用作猝灭剂，以消除不需用的荧光。因此荧光物质的保存应注意避免光（特别是紫外光）的直接照射和与其他化合物的接触。在荧光抗体技术中常用一些非荧的色素物质如亚甲蓝、碱性复红。伊文思蓝或低浓度的过锰酸钾、碘溶液等对标本进行得当复染，以减弱非特异性荧光本质，使特异荧光更突出显示。荧光抗原法是利用已知的荧光标记物来追踪或检查相应抗体的方法。

荧光物质，荧光色素：许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用作荧光色素。只有那些能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合物才能称为免疫荧光色素或荧光染料。常用的荧光色素有：⑴异硫氰酸荧光素为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。分子量为389.4，较大吸收光波长为490--495nm，较大发射光波长520--530nm，呈现明亮的黄绿色荧光，结构式如下：有两种同分异结构，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性、与蛋白质结合能力等方面都更好，在冷暗干燥处可保存多年，是应用较普遍的荧光素。其主要优点是：①人眼对黄绿色较为敏感，②通常切片标本中的绿色荧光少于红色。⑵四乙基罗丹明为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精。性质稳定，可长期保存。结构式如下：较大吸收光波长为570nm，较大发射光波长为595～600nm，呈橘红色荧光。⑶四甲基异硫氰酸罗丹明结构式如下：较大吸引光波长为550nm，较大发射光波长为620nm，呈橙红色荧光。与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。其异硫氰基可与蛋白质结合，但荧光效率较低。免疫荧光技术可以用于研究细胞凋亡、细胞增殖和细胞分化等生物学过程。CK7即用免疫荧光检查

免疫荧光技术是基于免疫学、生物化学和显微镜技术的重要方法之一。mpo免疫组化

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