Vimentin免疫荧光IF

免疫荧光法是将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位。用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞(或组织)化学技术。免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体(或抗原)作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光(黄绿色或桔红色)，可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位。免疫荧光技术是基于免疫学、生物化学和显微镜技术的重要方法之一。Vimentin免疫荧光IF

免疫荧光-实验步骤：细胞爬片免疫荧光：在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次,每次5min;（圆盖片：13mm24孔；18mm12孔；20mm6孔）用4%的多聚甲醛固定爬片15min,PBS浸洗玻片3次,每次5min0.5%TritonX-100(PBS配制)室温通透20min(细胞膜上表达的抗原省略此步骤);PBS浸洗玻片3次,每次3min,吸水纸吸干PBS,在玻片上滴加3%的BSA（PBS配置）,室温封闭30min5,吸水纸吸掉封闭液,不洗,每张玻片滴加足够量用PBS稀释好的一抗并放入湿盒,4℃孵育过夜。加荧光二抗:PBS浸洗爬片3次,每次5min,吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗,湿盒中室温孵育50min。PDL-1/CD274免疫检测早期的免疫荧光技术是将抗体与示踪物质结合，用于定位组织或细胞内的抗原物质。

荧光素标记抗体的方法：方法及步骤：①抗体的准备：取适量已知球蛋白浓度之溶液，置入三角烧瓶中，加入生理盐水及碳酸盐缓冲液，使然后蛋白浓度为20mg/ml，缓冲液容量为总量的1/10，混匀，将三角烧瓶置冰槽中，电磁搅拌（速度适当以不起泡沫为宜）5～10min。②荧光素的准备：根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克蛋白加0.01mg荧光素，用分析天平准确称所取所需的异硫氰酸荧光素粉末。③结合（或称标记）：边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中，避免将荧光素粘于三角烧瓶壁或搅拌玻棒上（大约5～10min内加完），加毕后，继续搅拌12～18h。结合期间应保持蛋白溶液于4℃左右，故须及时添冰去水；亦可将结合装置安放在4℃冰箱或冰库中。

细胞免疫荧光实验注意事项：根据所检测抗原所在位置来确认是否需要加入 Triton 进行通透。若所检测抗原表位位于膜蛋白的白外段，则不需要通透；一般 5% BSA 封闭即可达到效果；从加荧光二抗起，后面所有操作步骤尽量避光。缩短在荧光显微镜下的观察时间，1~2 h 为宜。染色后尽快荧光显微镜下观察，若不能可放入 4 ℃ 冰箱避光保存一周。无/弱染色：烤片温度过高，推荐 56~60 ℃ 1~2 h；一抗是否适用固定液和石蜡切片，使用浓度是否过低，孵育是否时间过短等。免疫荧光技术可以用于研究免疫相关疾病和自身免疫病。

通过不同颜色荧光标记不同的靶标，可以直观的观察同一样品细胞内不同结构和蛋白。荧光标记靶标的方法主要包括荧光染料、免疫标记、荧光融合蛋白等——这几种方法均可选择性标记细胞内的结构和蛋白，让您在成像时更轻松地进行观察。细胞生物学采用的很多荧光工具基本上都是荧光基团。这些荧光基团经过不同的方法修饰或结合到不同的分子上，从而具备了某些的功能与特定的细胞器或蛋白结合。通过化学修饰，单个荧光基团可以产生许多变体形式，且每种变体都有不同的特异性。免疫荧光技术可以用于研究内脏移植和免疫抑制。PDX-1免疫组化

免疫荧光技术可以用于研究植物病理学和农业生产。Vimentin免疫荧光IF

细胞免疫荧光实验注意事项：非特异性染色：是否灭活内源性过氧化物酶；孵育过程中干片；抗原热修复过度。染色过深：一抗浓度过高；染色试浓度过高或孵育时间过长；染色剂浓度过高或孵育时间过长。通常实验室先固定细胞再进行通透，但若检测抗原是水不溶性蛋白，可先通透再固定，这样可以通过通透去除一些水溶性蛋白，进而可降低免疫荧光背景和非特异性信号；建议设阴性对照组，消除由于抗体非特异性结合而产生的背景染色；选择醛类固定液时，保持其新鲜度，较好现配现用，使用不新鲜的醛类固定液自发荧光背景会升高。Vimentin免疫荧光IF

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