病毒作为基因载体已普遍用于基因和细胞医治产品。目前常见的病毒载体包括慢病毒(Lentiviral)、逆转录病毒(Retrovirus)、腺病毒(Adenovirus)、腺相关病毒(AAV)等。在生产过程中,如果被有复制能力的病毒污染,或载体发生重组,病毒载体中可能会混杂有复制型病毒。复制型慢病毒/逆转录病毒(RCL/RCR)可将病毒基因组整合到细胞基因组中,存在激 活原ai基因、破坏抑ai基因造成二次中瘤的风险;同时因其具有复制性,且用水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)替代了env编码的包膜糖蛋白,提高了病毒的嗜性范围,增加RCR/RCL带来的潜在风险;而如果出现复制型腺相关病毒(rcAAV),其则会在被感 染的细胞中表达cap或rep基因,容易导致意外的免疫反应。因此,各国法规对复制性 病毒检测都提出了明确要求。为什么要做复制型慢病毒检测?杭州病毒检测价格
复制型病毒/病毒载体回复突变(ReplicationCompetentVirus,RCV),可产生于病毒载体制造过程中的所有步骤当中。并且,RCV感 染宿主细胞后能随宿主细胞在培养液中增殖、扩增对人体健康具有严重的隐患,是免疫细胞治 疗类产品,如CAR-T产品的主要安全性风险之一。近年来,CAR-T细胞制备过程中,伴随载体的不断升级优化,重组产生的复制型逆转录病毒/慢病毒(ReplicationCompetentRetrovirus/Lentivirus,RCR/RCL)逐渐降低,但产生RCR/RCL的风险隐患至今仍不能完全排除。由2022年5月发布的《体外基因修饰系统药学研究与评价技术指导原则(试行)》指出RCR/RCL检测作为安全性检测在细胞药物的研发和生产过程中至关重要,相关产品不得检出RCR/RCL,可知病毒载体相关产品中,RCR/RCL病毒检测至关重要。杭州病毒检测价格复制型病毒检测试剂盒适用性样品有哪些?
用qPCR进行rcAAV复制型腺相关病毒检测时,哪些因素会对检测结果准确性和方法灵敏度存在较大影响?参考品DNA量值溯源及质量保证:参考品DNA的量值准确与否,直接关系到样品检测结果的准确性,因此需制定完善的参考品量值溯源程序,确保结果准确可靠。参考品DNA的质量要求可从条带大小、完整性、纯度、浓度等方面做多面评估,细胞来源的参考品应考察支原体污染,质粒参考品应考察质粒宿主E.coli基因组DNA残留情况等,尽量排除干扰确保结果准确可靠。
南京正扬生物科技有限公司自主研发生产的RCL基因拷贝数检测试剂盒(RT-PCR荧光探针法)、RCR基因拷贝数检测试剂盒(RT-PCR荧光探针法)、rcAAV-5/N检测试剂盒(PCR-荧光探针法)既适用于基于细胞培养法对复制型病毒的qPCR法的检测,也适用于对无细胞基质的病毒收获液(上清液)等样品的复制型病毒检测。试剂盒进行了多面的性能验证,灵敏度高、特异性强、稳定性好、符合法规要求。南京正扬生物科技有限公司自主研发生产的RCL基因拷贝数检测试剂盒(RT-PCR荧光探针法)、RCR基因拷贝数检测试剂盒(RT-PCR荧光探针法)、rcAAV-5/N检测试剂盒(PCR-荧光探针法)既适用于基于细胞培养法对复制型病毒的qPCR法的检测,也适用于对无细胞基质的病毒收获液(上清液)等样品的复制型病毒检测。试剂盒进行了多面的性能验证,灵敏度高、特异性强、稳定性好、符合法规要求。复制型逆转录病毒检测要求有哪些?
复制性慢病毒/复制性逆转录病毒检测的背景:慢病毒载体来源于病原体HIV-1,为了保证产品的安全性,目前基因医治产品所用的慢病毒载体/逆转录病毒载体均为非复制性。通过将基因组中的辅助蛋白删除,并将结构基因分别通过3-4个质粒系统进行分别包装,形成三质粒系统或者四质粒系统,如图1所示,极大的降低了产生具有复制能力慢病毒的可能性,这意味着至少需要2-3次完整的重组时间才能产生一个具有复制能力的慢病毒,在此基础上进一步修饰改造,构建自失活的慢病毒载体(SIN),极大的提供包装病毒的安全性,此外使用VSV-G蛋白取代env蛋白增加载体的稳定性及受体细胞范围。RCL/RCR产生的主要原因是转移载体和包装载体同源序列的重组。随着新的载体系统的发展与应用,载体系统中各元件之间发生同源重组的变化导致RCL/RCR生成机制和结构的变化愈加复杂。而且,重组不仅限于载体系统之间各组分发生的重组,也包括载体成分和细胞基因组之间的重组。复制型慢病毒检测要求有哪些?宁波RCL病毒检测优缺点
南京正扬有复制型病毒检测试剂盒试剂盒性能如何?杭州病毒检测价格
RCL/RCR病毒检测的方法FDA推荐的RCL检测方法是利用敏感细胞对病毒载体中可能存在的RCL进行培养扩增,并在培养终点进行检测。•扩增期:将待测物与对HIV-1易感并且可大量扩增病毒的细胞系(通常用C8166)孵育,细胞传代5次以上,培养至少3周。•指示期:3周后收集培养上清,接种于C8166细胞中培养7d后检测RCL标志物。•检测:A:P24ELLISA的方法:适用于由载体制备过程中病毒基因组之间的重组形成RCL的检测。B:PERT法:当RCL进行扩增后,也可应用PERT检测方法测定逆转录酶活性。该方法的缺点是在某些细胞中存在高背景。C:qPCR方法:采用实时定量PCR方法(Q-PCR)测定假型病毒杭州病毒检测价格
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