逆转录实验过程中要注意RNA样品的保存、纯化、处理和转录酶的选择,逆转录实验前要对反应体系进行无RNA和无反转录酶的对照。多逆转录酶都具有多种酶活性,主要包括以下几种活性。①RNA指导的DNA聚合酶活性;以RNA为模板,催化dNTP聚合成DNA的过程。此酶需要RNA为引物,多为色氨酸的tRNA,在引物tRNA3′-末端以5′→3′方向合成DNA。反转录酶中不具有3′→5′外切酶活性,因此没有校正功能,所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较高。②RNaseH活性;由反转录酶催化合成的cDNA与模板RNA形成的杂交分子,将由RNaseH从RNA5′端水解掉RNA分子。逆转录可改变RNA的信息内容,为研究RNA功能提供基础。扬州一步法逆转录混合
逆转录过程由逆转录酶催化,此酶也称依赖RNA的DNA聚合酶(RDDP),即以RNA为模板催化DNA链的合成。合成的DNA链称为与RNA互补DNA(complementaryDNA,cDNA)。逆转录酶在生物界存在于逆转录病毒以及真核细胞(如端粒酶)中,拟逆转录病毒没有单独的逆转录酶,其DNA聚合酶带有逆转录酶的活性,可能与病毒的恶性转化有关。人类免疫缺陷病毒(HIV)就是一种逆转录病毒,含有逆转录酶。在小鼠及人的正常细胞和胚胎细胞中也有逆转录酶,例如端粒酶就是一种逆转录酶,推测可能与细胞分化和胚胎发育有关。武汉彩色反转录报价逆转录活性可以RNA为模板,合成与其序列互补的DNA链,生成DNA-RNA杂合双链。
逆转录引物:加尾法逆转录引物的结构并不是想象中那么简单的oligodT,其包含三个关键结构:①为了与PolyA序列互补配对,OligodT序列必不可少。②在OligodT序列的5端,存在一段通用序列,用于qPCR过程中反向引物与cDNA的结合。③OligodT序列的3端存在一个或两个锚定碱基,V或者VN。(兼并碱基,V表示A、G或C,N表示ATCG中的任意一种)。如果没有锚定碱基,逆转录引物中的OligodT就会随机结合到PolyA的任意位置,这样会造成同一miRNA的逆转录产物长度不一,给较后的熔解曲线检测带来麻烦。因此,锚定碱基的作用就是特异性地结合到miRNA上,从而让逆转录引物结合到紧挨着miRNA的那段PolyA序列上。只有这样,才能够保证同一miRNA的逆转录产物大小相同。
人体中也有逆转录过程,比如端粒的复制。端粒(telomere)是染色体末端的特殊结构,由重复的DNA序列(TTAGGG)和核的蛋白组成,可以保护染色体末端,维持基因组完整性。端粒的末端是单链3'末端,形成一种紧凑的T环结构,可保持其稳定性。其表面覆盖着Shelterin复合物,包括TRF1(端粒重复结合因子1)、TRF2(端粒重复结合因子2)、TIN2(TRF1相互作用核的蛋白2)、RAP1(rif相关蛋白)、POT1(端粒保护)和TPP1(端粒保护蛋白1)成功将人表皮干细胞体外分离培养的基础上,对比观察不同发育阶段人表皮干细胞端粒酶反转录酶表达的差异特征,结果表明人胚胎、少儿、成人皮肤来源的表皮干细胞均有端粒酶反转录酶表达,其表达强度依次减弱。提示诱导和增强端粒酶反转录酶的表达对维持表皮干细胞在体外自我更新和增殖能力可能具有重要意义。逆转录实验后的DNA的片段可用于测序等高通量技术。
大多数逆转录酶都具有多种酶活性,主要包括以下几种活性。①DNA聚合酶活性;以RNA为模板,催化dNTP聚合成DNA的过程。此酶需要RNA为引物,多为赖氨酸的tRNA,在引物tRNA3'-末端以5'→3'方向合成DNA。反转录酶中不具有3'→5'外切酶活性,因此没有校正功能,所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较高。②RNaseH活性;由反转录酶催化合成的cDNA与模板RNA形成的杂交分子,将由RNaseH从RNA5'端水解掉RNA分子。③DNA指导的DNA聚合酶活性;以反转录合成的首先条DNA单链为模板,以dNTP为底物,再合成第二条DNA分子。逆转录现象说明:至少在某些生物中,RNA同样兼有遗传信息传递和表达功能。北京miQP2逆转录混合费用
逆转录实验避免RNA样品的过冻、过热处理,影响逆转录反应的效果。扬州一步法逆转录混合
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