反转录酶的注意事项，随机引物：适合各种RNA的RT，尤其适合模板丰度很低的情况（比如某个gene表达量很低）。选择随机引物时，首先链cDNA合成反应中就是以所有的RNA为模板，然后进行PCR反应时设计引物进行特异性扩增。同时要注意随机引物的量和总RNA量之间的关系，一般建议每5μg总RNA的随机引物的用量为50ng，如果每5μg总RNA的随机引物的用量超过250ng，可能会导致小片段产物（<500bp）的增加和长片断、全长产物产物的降低。酵母菌逆转录酶是逆转录酶家族中的一个重要表示，逆转录在研究RNA表达调控等领域有普遍的应用前景。逆转录反应首先需要逆转录酶的反应活性。上海加尾法逆转录酶测序
RNA逆转录实验注意事项：去除基因组DNA污染：残留的基因组DNA(gDNA)会对荧光定量结果造成很大的干扰，为了使结果更加的真实、可重复，我们需要去除gDNA干扰。我们可以在引物设计时避免gDNA的扩增，比如将上下游引物分别设在不同的外显子上；或者在提取RNA后使用DNaseI处理以除去gDNA。较后，我们还有非常法宝，选择一款具有gDNA去除功能的逆转录试剂盒，一步到位去除gDNA，省心省力max。RNA逆转录实验注意事项：逆转录酶热稳定性：逆转录酶在整个反转录体系中具有关键性影响。除了活性以外，逆转录酶的热稳定性同样很重要，在较高温度下进行逆转录，能够减少RNA的二级结构，增加逆转录的效率。野生型的M-MLV逆转录酶很“怕热”，高于37℃时，稳定性大幅下降。一体化逆转录混合供货商逆转录酶通常具有多种活性，如逆转录活性、复制活性与RNA酶H活性。
miRNA加尾法逆转录：miRNA加尾法利用基因组中压缩miRNA元件，通过识别不同转录起始位置，将miRNA连接到其前体mRNA上这种方法可以注意到与miRNA相关的各种信息，例如miRNA功能特异性，miRNA的转录条件和miRNA的表达量等。miRNA的逆转录允许科学家们用特定的miRNA测序技术来节省时间。miRNA逆转录，可以检测miRNA的表达以及miRNA与RNA的瓦作关系，还可以检测miRNA的调节的位点。同样，miRNA表达量的研究也能够通过miRNA逆转录来进行，从而帮助我们更好地了解miRNA在细胞信号转导中发挥着重要作用。
逆转录实验步骤：用SSⅢ逆转录酶进行RT（20ul体积）1、准备0、65ml的EP管。2、冰上操作：在EP管中加入10ulDEPC水，1ul引物，1ul模板RNA，1uldNTP，短暂离心。3、65℃水浴5分钟后，立刻0℃冰水浴至少1分钟。4、短暂离心后，冰上操作：加入4ul5×First-StrandBuffer，1ul0.1MDTT，1ulRNAseInhibitor，1ulSSⅢ逆转录酶。5、短暂离心。6、50℃水浴60分钟进行逆转录。7、70℃水浴15分钟灭活逆转录酶。8、－20℃保存，或立即进行PCR。MCERTmix含有比例优化的Oligo(dT)和RandomPrimers，使cDNA合成可从RNA转录本的各个区域起始，并具有相同的逆转录效率，较大程度保证qPCR结果的真实性和可重复性。逆转录在病毒学、免疫学等领域有普遍的应用。
逆转录是指以RNA为模板合成DNA的过程，即将遗传信息由RNA逆向传给DNA的过程，其遗传的传递方向与转录相反。反转录酶也可写成逆转录酶又称为依赖RNA的DNA聚合酶。是以RNA为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNA（cDNA）的酶。哺乳类C型病毒的反转录酶和鼠类B型病毒的反转录酶都是一条多肽链。鸟类RNA病毒的反转录酶则由两上亚基结构。真核生物中也都分离出具有不同结构的反转录酶。RNA指导的DNA聚合酶活性；以RNA为模板，催化dNTP聚合成DNA的过程。此酶需要RNA为引物，多为色氨酸的tRNA，在引物tRNA3′－末端以5′→3′方向合成DNA。反转录酶中不具有3′→5′外切酶活性，因此没有校正功能，所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较高。逆转录实验中引物设计时要注意反向引物特异性和长度，避免循环扩增和特异性问题。北京miQP2逆转录蛋白检测
逆转录实验过程中避免光照，防止RNA样品和试剂受光降解或刺激。上海加尾法逆转录酶测序
反转录酶的注意事项，在进行RT反应之前，应考虑以下几个方面：RNA：成功的cDNA合成来自高质量的RNA，高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。在提取RNA的过程中，要特别防止RNase的污染，同时在逆转录反应中经常加入RNase抑制剂以增加cDNA合成的长度和产量。RNase抑制剂要在首先链cDNA合成反应中，在缓冲液和还原剂（如DTT）存在的条件下加入，因为cDNA合成前的过程会使抑制剂变性，从而释放结合的可以降解RNA的RNase。蛋白RNase抑制剂只防止RNaseA，B，C对RNA的降解，并不能防止皮肤上的RNase，因此尽管使用了这些抑制剂，也要小心不要从手指上引入RNase，实验过程中经常更换新手套。上海加尾法逆转录酶测序
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