逆转录是指以RNA为模板合成与其互补的cDNA的过程。逆转录PCR是将RNA的逆转录(reversetranscription)和cDNA的聚合酶链式反应(PCR)相结合的技术,故逆转录称为RT-PCR或反转录PCR。逆转录PCR实验原理是,提取组织或细胞中的总RNA,以RNA为模板,利用逆转录酶反转录成cDNA,再以cDNA链为模板进行PCR扩增,从而获得大量拷贝。逆转录PCR的出现使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级,使一些极为微量RNA样品分析成为可能。RNA逆转录实验注意事项:选择合适的引物:随机引物法逆转录产生的片段较小,很难得到全长转录本的cDNA。单独选择某一种引物,实验可能都不完美,具体需要根据实验目的来确定。逆转录实验中引物设计时要注意反向引物特异性和长度,避免循环扩增和特异性问题。南昌cDNA合成反转录
逆转录的转录过程:基因的转录是由RNA聚合酶催化进行的。基因的上游具有结合RNA聚合酶的区域,叫作启动子。启动子是一段具有特定序列的DNA,具有和RNA聚合酶特异性结合的位点,决定了基因转录的起始位点。RNA聚合酶与启动子结合后,在特定区域将DNA双螺旋两条链之间的氢键断开,使DNA解旋,形成单链区,以非编码链为模板合成RNA互补链的过程就开始了。转录的延长是以前面核苷酸的3′-OH为基础逐个加入NTP,形成磷酸二酯键,使RNA逐步从5′向3′端延伸的过程。在原核生物中,因为没有核膜的分隔,转录未完成即已开始翻译,而且在同一个DNA模板上同时进行多个转录过程。电镜下看到的羽毛状图形和羽毛上的小黑点(多聚核糖体),是转录和翻译高效率的直观表现。一步法逆转录酶报价逆转录实验过程中要注意RNA样品的保存、纯化、处理和转录酶的选择。
逆转录PCR的用途普遍,可用于分析基因的转录产物、检测细胞中RNA病毒的含量、合成cDNA探针、直接克隆特定基因的cDNA序列等。如在临床上RT-PCR可以用于遗传病诊断、病症检测、检测病人标本中的RNA病毒,如HAV、HCR、HIV等。在植物方面RT-PCR常用于研究环境胁迫对植物基因表达的影响,以及在特定的环境或生长阶段中植物体不同部位基因表达的差异性。使用RT-PCR检测分析RNA转录产物具有以下突出的优点:理论上可以检测几乎任何基因的转录产物;可以实现极为微量RNA样品(ng级别)的检测;样品耐受性好,未经纯化的粗制生物样品也可以用于检测。
miRNA加尾法及其逆转录是近年来普遍用于miRNA研究的一种技术。它可以帮助我们深入理解miRNA的调控机制,它质量得到改进,效率也得到提高从而为miRNA研究提供了非常重要的资源。未来,miRNA加尾法及其逆转录一定会成为miRNA研究的重要部分,为miRNA研究提供更多有价值的信息。逆转录是一种重要的生物学现象,它在病毒的复制过程中发挥着重要的作用。同时,逆转录还可以作为基因的调节机制,从而控制基因的表达和功能。我们相信,在未来的研究中,逆转录的研究将会取得更多的进展,并且会为治着某些疾病提供更多的帮助。逆转录在研究RNA表达调控等领域有普遍的应用前景。
逆转录实验过程中要注意RNA样品的保存、纯化、处理和转录酶的选择,逆转录实验前要对反应体系进行无RNA和无反转录酶的对照。多逆转录酶都具有多种酶活性,主要包括以下几种活性。①RNA指导的DNA聚合酶活性;以RNA为模板,催化dNTP聚合成DNA的过程。此酶需要RNA为引物,多为色氨酸的tRNA,在引物tRNA3′-末端以5′→3′方向合成DNA。反转录酶中不具有3′→5′外切酶活性,因此没有校正功能,所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较高。②RNaseH活性;由反转录酶催化合成的cDNA与模板RNA形成的杂交分子,将由RNaseH从RNA5′端水解掉RNA分子。逆转录实验前要对反应体系进行无RNA和无反转录酶的对照。南昌cDNA合成反转录
逆转录酶是逆转录过程中的重要酶类。南昌cDNA合成反转录
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