上海茎环法反转录

逆转录实验的准备工作：1、实验器具与材料：（1）移液头：200ul、10ul；（2）吸头：200ul、20ul；（3）EP管1。5ml、100ul；（4）水浴箱。2、实验器具的处理与准备，塑料制品：（包括吸头、EP管等）将塑料制品逐个浸泡于1‰DEPC水中（必要时小头头需要用吸管打入DEPC水）37℃过夜，然后送至高压3次，后在80℃烘烤箱中烘干（或置于37℃中8小时左右烘干），试验前将头头放入吸头台。3、试剂配制和准备：（1）DEPC水：泡实验器具的DEPC水的配制：1000ml双蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中静置4小时后备用。逆转录中所用的DEPC水的配制：100ml盐水瓶内装40ml双蒸水，加40ulDEPC，37℃过夜，送至高压，后分装到几个1。5mlEP管中，-20℃中保存备用。（2）RT中所需要的各种试剂。逆转录后的DNA可直接用于基因克隆或测序等应用。上海茎环法反转录

大多数逆转录酶都具有多种酶活性，主要包括以下几种活性。①DNA聚合酶活性；以RNA为模板，催化dNTP聚合成DNA的过程。此酶需要RNA为引物，多为赖氨酸的tRNA，在引物tRNA3'－末端以5'→3'方向合成DNA。反转录酶中不具有3'→5'外切酶活性，因此没有校正功能，所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较高。②RNaseH活性；由反转录酶催化合成的cDNA与模板RNA形成的杂交分子，将由RNaseH从RNA5'端水解掉RNA分子。③DNA指导的DNA聚合酶活性；以反转录合成的首先条DNA单链为模板，以dNTP为底物，再合成第二条DNA分子。西安带gDNA Remover逆转录混合逆转录技术应用于人类基因组的研究。

miRNA的加尾法逆转录和qPCR，miRNA与mRNA不同，成熟的miRNA的长度只有20nt左右，非常短，通常正向引物就足以覆盖其全长甚至有余，反向引物就无处安放了。那么如何实现miRNA的qPCR扩增呢？解决方案就是在逆转录的时候设法增加逆转录产物长度。普遍的方法有两种，加尾法和茎环法。经过加尾法或茎环法这种特殊的逆转录形式处理之后，得到的cDNA长度从原始的20nt增加到80nt以上，这样就能够实现miRNA的qPCR扩增了。RNA逆转录实验注意事项：选择合适的引物：但其对RNA的完整度和二级结构的要求较高，而且不适用于原核生物。随机引物可以根据碱基情况结合到几乎所有的RNA上，包括mRNA、tRNA和rRNA。

RT-PCR就是逆转录PCR或称为反转录PCR（Reversetranscription-PCR，RT-PCR），是以RNA为材料应用于PCR扩增中的一种实验方法。首先通过逆转录酶将总RNA或信使RNA（mRNA）转录成互补DNA（cDNA）。其次TaqDNA聚合酶以cDNA为模板进行qPCR扩增。RT-PCR已被普遍应用于多种分子生物学应用中，包括基因表达分析、基因测试、RNA干扰验证检测、微阵列验证、病原体检测和疾病研究。RT-PCR的方法之一步法和两步法：RT-PCR其操作方法分为两种，即一步法和两步法。一步法RT-PCR，逆转录同PCR扩增结合在一起，即cDNA合成与PCR扩增反应在同一管Buffer及酶中进行，一步完成。两步法RT-PCR，RNA首先在反转录酶的作用下生成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，分成两步进行。逆转录实验可以选择加入RNA合成抑制剂RNAse防止RNA降解和污染。

逆转录酶的合成步骤：1、使用前每个组份轻轻混匀，然后2000rpm离心20s；2、取灭过菌且无核酸酶的0.2ml离心管，依次加入2～5μgRNAnμL；3、65℃保温5min，然后冰浴5min；4、往3步骤中的0.2ml离心管依次加入下列组份：RNase抑制剂（40u/μL）0.5μL、10×M-MLVReactionBuffer2μL、DTT（200mM）1μL、逆转录酶（M-MLV）1μL；5、轻轻混匀后，然后2000rpm离心20s；6、先在37℃保温1hr，然后70℃保温15min；7、上述产物可立即进行下一步的PCR反应或-20℃保存。逆转录酶的质量控制：物理纯度：在SDS－PAGE上>90%纯。储存缓冲液：20mMTris-HClpH7.5；200mMNaCl；0.1mMEDTA；1mMDTT；0.01%NP-40(一种去垢剂)和50%甘油。反应缓冲液：250mMTris-HClpH8.3；375mMKCl；15mMMgCl2；50mMDTT(以Part#M531A供应)。逆转录活性可以RNA为模板，合成与其序列互补的DNA链，生成DNA-RNA杂合双链。西安带gDNA Remover逆转录混合

逆转录实验中的RNA样品处理时要避免使用酸性物质、有机溶剂和酶切酶剂。上海茎环法反转录

逆转录酶的质量控制：1.切口酶：在与200单位酶37oC保温60分钟后，超螺旋质粒保留在90%以上。2.DNase测定：200单位酶与50ng3H-DNA37oC保温60分钟，分解出的放射性低于1%。3.RNase测定：200单位酶与50ng3H-RNA37oC保温60分钟，分解出的放射性低于3%。4.首先链cDNA的反应：在标准化的反应中，200单位酶催化从1mg1.2kbRNA或1mg7.5kbRNA将同位素掺入到cDNA中，通过放射自显影，对于1.2kb的RNA，产物cDNA是单一的、全长的条带。对于7.5kb的RNA产物有部分是全长的条带。用这二种RNA放射性转换到cDNA中有12%。5.RNaseH活性：200单位酶与polyA:polydT37oC保温60分钟，释放出的放射性要低于1%。上海茎环法反转录

苏州英泽生物医药科技有限公司在RNA\DNA试剂盒，外泌体提取试剂盒，逆转录试剂盒，荧光定量PCR一直在同行业中处于较强地位，无论是产品还是服务，其高水平的能力始终贯穿于其中。公司成立于2016-10-20，旗下EZB,EZBioscience,EZMED，已经具有一定的业内水平。英泽生物以RNA\DNA试剂盒，外泌体提取试剂盒，逆转录试剂盒，荧光定量PCR为主业，服务于医药健康等领域，为全国客户提供先进RNA\DNA试剂盒，外泌体提取试剂盒，逆转录试剂盒，荧光定量PCR。英泽生物将以精良的技术、优异的产品性能和完善的售后服务，满足国内外广大客户的需求。