逆转录酶实验流程：从细胞材料中提取RNA→RNA加入到含有逆转录酶、引物、dNTPs的反应体系中→退火，引物与RNA链配对→延伸，逆转录酶合成互补cDNA链变性→常规PCR反应流程（变性、退火、延伸，如此多次循环）。RT-PCR“两步法”与“一步法”RT-PCR的实验操作分为“一步法”与“两步法”两种。一步法RT-PCR能克隆微量mRNA而不需构建cDNA文库（即cDNA合成与PCR反应在同一Buffer及酶中进行，一步法完成），省略了cDNA与PCR之间的过程。两步法RT-PCR首先用反转录酶合成cDNA，然后以cDNA为模板进行PCR，即RNA反转录与PCR扩增分两步进行。逆转录引物的设计需要考虑反向引物的特性。青岛一体化逆转录酶
反转录酶的选择：反转录酶（Reversetranscriptase）又称逆转录酶。是以RNA为模板指导dNTP合成互补DNA（cDNA）的酶。一部分反转录酶具有RNA酶活性，能够在转录后降解RNA-DNA杂交链中的RNA链。如果反转录酶没有Rnase酶活性，可加入RNaseH来获得更高的qPCR效率。常用的酶包括Money鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶和禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶。依据RT-PCR，理想的状态下是选择具有较高热稳定性的反转录酶，cDNA的合成才能在较高的温度下进行，确保成功转录具有较高二级结构的RNA，并确保在整个反应过程中的全部活性，从而得到质量更高的cDNA。青岛一体化逆转录酶逆转录实验避免RNA样品的过冻、过热处理，影响逆转录反应的效果。
miRNA的加尾法逆转录和qPCR，miRNA与mRNA不同，成熟的miRNA的长度只有20nt左右，非常短，通常正向引物就足以覆盖其全长甚至有余，反向引物就无处安放了。那么如何实现miRNA的qPCR扩增呢？解决方案就是在逆转录的时候设法增加逆转录产物长度。普遍的方法有两种，加尾法和茎环法。经过加尾法或茎环法这种特殊的逆转录形式处理之后，得到的cDNA长度从原始的20nt增加到80nt以上，这样就能够实现miRNA的qPCR扩增了。RNA逆转录实验注意事项：选择合适的引物：但其对RNA的完整度和二级结构的要求较高，而且不适用于原核生物。随机引物可以根据碱基情况结合到几乎所有的RNA上，包括mRNA、tRNA和rRNA。
逆转录酶实验一步法与两步法具有以下区别：一步法比两步法更快速、简便、减少了污染机会、减少了RNA二级结构、减少了PCR反应的错配率；两步法的优势在于中间产物cDNA，便于保存；且第二步PCR只取逆转录反应产物的1/10进行反应，有利于PCR条件的调整，实验重现性强；两步法可以在第二步PCR反应体系中加入特异性引物，其灵敏度比一步法高；两步法包括首先链cDNA合成和随后的PCR反应，容易产生污染问题；两步法的实验预算要低于一步法。实时荧光PCR检测需要经过逆转录反应。
大多数逆转录酶都具有多种酶活性，主要包括以下几种活性。①DNA聚合酶活性；以RNA为模板，催化dNTP聚合成DNA的过程。此酶需要RNA为引物，多为赖氨酸的tRNA，在引物tRNA3'－末端以5'→3'方向合成DNA。反转录酶中不具有3'→5'外切酶活性，因此没有校正功能，所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较高。②RNaseH活性；由反转录酶催化合成的cDNA与模板RNA形成的杂交分子，将由RNaseH从RNA5'端水解掉RNA分子。③DNA指导的DNA聚合酶活性；以反转录合成的首先条DNA单链为模板，以dNTP为底物，再合成第二条DNA分子。逆转录的反应机理是RNA模板上的DNA合成。青岛一体化逆转录酶
逆转录是一种将RNA反转录为DNA的生物化学过程。青岛一体化逆转录酶
miRNA的加尾法逆转录和qPCR，miRNA与mRNA的在qRT-PCR过程有所不同。一般来讲，mRNA比较长，其长度通常在几百至几千个核苷酸，因此使用随机引物(RandomPrimerp(dN)6)即可随机结合到mRNA的各位置进行逆转录。由于qPCR的过程只需扩增目的片段的一部分(80~200bp)，因此使用随机引物的逆转录产物尽管不完整，也完全能够满足qPCR的需求。当然，也可以使用OligodT引物统一从mRNA的ployA尾巴开始逆转录。这种逆转录引物在扩增cDNA全长时是必须的，但要注意，原核生物的mRNA和某些lncRNA不具有ployA尾，因此不能使用OligodT引物进行逆转录。青岛一体化逆转录酶
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