RT-PCR逆转录引物设计原则：1.上下游引物要保守：扩增子长度需选择一段保守片段（100-200bp）进行PCR扩增，选择片段需跨越内含子，因内含子的基因组DNA序列不会被扩增，也可减少从污染的基因组DNA中扩增得到的假阳性风险。引物选取同样需要保守。2.引物长度和Tm值：引物设计长度为18-25bp，Tm值在50-65℃之间，引物中GC含量在40-60%。设计引物时尽量避免出现4个或超过4个G碱基。RT-PCR实验阴性对照：反转录阴性对照应包括在所有的RT-PCR的实验中，用来检测DNA是否污染（如基因组DNA或PCR产物）。该对照所指不加反转录酶，通过反转录过程得到cDNA在进行荧光定量PCR检测。如检测到扩增，则样本中可能含有基因组DNA污染。逆转录实验过程需适当的RNA质量，过少或质量不佳将影响扩增效果。杭州彩色反转录价格
逆转录酶的质量控制：1.切口酶：在与200单位酶37oC保温60分钟后，超螺旋质粒保留在90%以上。2.DNase测定：200单位酶与50ng3H-DNA37oC保温60分钟，分解出的放射性低于1%。3.RNase测定：200单位酶与50ng3H-RNA37oC保温60分钟，分解出的放射性低于3%。4.首先链cDNA的反应：在标准化的反应中，200单位酶催化从1mg1.2kbRNA或1mg7.5kbRNA将同位素掺入到cDNA中，通过放射自显影，对于1.2kb的RNA，产物cDNA是单一的、全长的条带。对于7.5kb的RNA产物有部分是全长的条带。用这二种RNA放射性转换到cDNA中有12%。5.RNaseH活性：200单位酶与polyA:polydT37oC保温60分钟，释放出的放射性要低于1%。杭州一步法逆转录纯度高逆转录酶通常具有多种活性，如逆转录活性、复制活性与RNA酶H活性。
反转录酶的注意事项，在进行RT反应之前，应考虑以下几个方面：RNA：成功的cDNA合成来自高质量的RNA，高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。在提取RNA的过程中，要特别防止RNase的污染，同时在逆转录反应中经常加入RNase抑制剂以增加cDNA合成的长度和产量。RNase抑制剂要在首先链cDNA合成反应中，在缓冲液和还原剂（如DTT）存在的条件下加入，因为cDNA合成前的过程会使抑制剂变性，从而释放结合的可以降解RNA的RNase。蛋白RNase抑制剂只防止RNaseA，B，C对RNA的降解，并不能防止皮肤上的RNase，因此尽管使用了这些抑制剂，也要小心不要从手指上引入RNase，实验过程中经常更换新手套。
逆转录时试剂没混匀会怎么样？会出现起泡现象。RT-PCR的试剂都应在冰上融化，等完全融化后再取；用过的试剂应瞬间离心后放回-20℃保存；试剂应按顺序加，加完后再混匀离心。使用ReverTra-Ace、RNase-Inhibitor等酶类时，没有混匀，会出现起泡现象；由于酶保存液中含有50%的甘油，粘度高，分取时应慢慢吸取。miRNA的RT-PCR:1）引物稀释：miRNARTPrimer储存液浓度：10μM。miRNARTPrimer工作液浓度：2μM。RTPrimer工作液配置：5μLRT-primer储存液+45μLDEPC水。miRNA前后引物的工作液（10μM）用储存液（100μM）稀释后分装，放入-20℃冰箱保存，避免反复冻融。逆转录过程中的缺陷会导致错误扩增和偏差。
逆转录酶（M-MLV）从MoloneyMurineLeukemiaVirus分离出来，可用于合成首先链cDNA、制作cDNA探针、RNA转录、测序和RNA的逆转录反应。本酶是通过点突变使RNaseH活性缺失，所以它具有的DNA聚合酶的活性与野生型相同，同时其延伸能力也有明显提高。逆转录酶（M-MLV）一个活性单位定义为在37℃，10min条件下，使1nmol的脱氧核糖核酸掺入酸性沉淀物质所需的酶量。逆转录酶的三个功能：1、RNA为模板指导的DNA聚合酶活性；2、DNA为模板指导的DNA聚合酶活性；3、RNaseh活性。逆转录实验完成反应后要及时保存和处理PCR产物，并记录实验数据和结果等。南京一步法逆转录试剂
逆转录的目的是将RNA变为DNA，便于PCR扩增。杭州彩色反转录价格
逆转录酶实验流程：从细胞材料中提取RNA→RNA加入到含有逆转录酶、引物、dNTPs的反应体系中→退火，引物与RNA链配对→延伸，逆转录酶合成互补cDNA链变性→常规PCR反应流程（变性、退火、延伸，如此多次循环）。RT-PCR“两步法”与“一步法”RT-PCR的实验操作分为“一步法”与“两步法”两种。一步法RT-PCR能克隆微量mRNA而不需构建cDNA文库（即cDNA合成与PCR反应在同一Buffer及酶中进行，一步法完成），省略了cDNA与PCR之间的过程。两步法RT-PCR首先用反转录酶合成cDNA，然后以cDNA为模板进行PCR，即RNA反转录与PCR扩增分两步进行。杭州彩色反转录价格
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