RT-PCR逆转录引物设计原则：1.上下游引物要保守：扩增子长度需选择一段保守片段（100-200bp）进行PCR扩增，选择片段需跨越内含子，因内含子的基因组DNA序列不会被扩增，也可减少从污染的基因组DNA中扩增得到的假阳性风险。引物选取同样需要保守。2.引物长度和Tm值：引物设计长度为18-25bp，Tm值在50-65℃之间，引物中GC含量在40-60%。设计引物时尽量避免出现4个或超过4个G碱基。RT-PCR实验阴性对照：反转录阴性对照应包括在所有的RT-PCR的实验中，用来检测DNA是否污染（如基因组DNA或PCR产物）。该对照所指不加反转录酶，通过反转录过程得到cDNA在进行荧光定量PCR检测。如检测到扩增，则样本中可能含有基因组DNA污染。逆转录实验反应过程中需控制反应温度，时间和pH值等指标。广州快速逆转录酶报价
逆转录是指以RNA为模板合成DNA的过程，即将遗传信息由RNA逆向传给DNA的过程，其遗传的传递方向与转录相反。反转录酶也可写成逆转录酶又称为依赖RNA的DNA聚合酶。是以RNA为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNA（cDNA）的酶。哺乳类C型病毒的反转录酶和鼠类B型病毒的反转录酶都是一条多肽链。鸟类RNA病毒的反转录酶则由两上亚基结构。真核生物中也都分离出具有不同结构的反转录酶。RNA指导的DNA聚合酶活性；以RNA为模板，催化dNTP聚合成DNA的过程。此酶需要RNA为引物，多为色氨酸的tRNA，在引物tRNA3′－末端以5′→3′方向合成DNA。反转录酶中不具有3′→5′外切酶活性，因此没有校正功能，所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较高。广州快速逆转录酶报价逆转录实验过程中要使用干燥无菌的管头和标本采集器避免受外界污染。
逆转录酶是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶。RT-PCR实验中的逆转录酶需要具有以下二种活性：依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA的首先条链。依赖DNA的DNA聚合酶活性：以一条DNA链为模板合成互补的双链DNA。在选择逆转录酶时，建议选择无RNaseH①活性（RNaseH-）的逆转录酶。具有RNaseH活性的逆转录酶的RNaseH活性会与聚合酶活性竞争RNA模板与DNA引物（或cDNA延伸链）形成的杂合链，并降解杂合链中的RNA链。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作为合成cDNA的有效底物，降低了cDNA合成的产量与长度。
逆转录酶实验一步法与两步法具有以下区别：一步法比两步法更快速、简便、减少了污染机会、减少了RNA二级结构、减少了PCR反应的错配率；两步法的优势在于中间产物cDNA，便于保存；且第二步PCR只取逆转录反应产物的1/10进行反应，有利于PCR条件的调整，实验重现性强；两步法可以在第二步PCR反应体系中加入特异性引物，其灵敏度比一步法高；两步法包括首先链cDNA合成和随后的PCR反应，容易产生污染问题；两步法的实验预算要低于一步法。逆转录实验相关关器材如逆转录仪需经常检查，以保证反应可靠性。
miRNA逆转录茎环法：首先需要进行RNA样品制备，可选的方法有：离心柱法抽提（不必去除gDNA）；传统Trizol法抽提（需要去除gDNA）。miRNA正向引物：需要分别设计。是否采用通用引物视情况而定，正向引物与通用反向引物不会形成二聚体时才能用。取200ul的PCR管，根据所得每组RNA的浓度C，每孔加入1000ng总RNA，按公式1000ng/C计算出所需RNA的体积x。然后按建议的20μL反应体系说明，依次向200μL的PCR管内加入下列试剂：加样结束后，移液器吹打混匀，低速离心数秒。将逆转录PCR管放入PCR扩增仪内，调整参数：37℃15min（反转录反应），85℃5s（反转录酶的失活反应），4℃∞。反应结束后根据实验需要进行荧光定量PCR或放入-20℃冰箱保存。说明：此处可以选择U6下游引物作为U6的逆转录引物，注意相应地调整无酶水的体积和反应温度。逆转录PCR反应过程中要注意反应管中溶液面积不宜过高，避免泡沫问题。广州快速逆转录酶报价
逆转录实验尽量避免多次冻融处理RNA样品，避免样品质量下降。广州快速逆转录酶报价
逆转录酶还有DNA内切酶活性，这可能与病毒基因整合到宿主细胞染色体DNA中有关。逆转录酶的发现对于遗传工程技术起了很大的推动作用，它已成为一种重要的工具酶。用组织细胞提取mRNA并以它为模板，在逆转录酶的作用下，合成出互补的cDNA，由此可构建出cDNA文库（cDNAlibrary），从中筛选特异的目的基因，这是在基因工程技术中较常用的获得目的基因的方法。简要过程表示：逆转录酶的作用是以dNTP为底物，以RNA为模板，tRNA(主要是色氨酸tRNA)为引物，在tRNA3'-末端上，按5'→3'方向，合成一条与RNA模板互补的cDNA单链，它与RNA模板形成RNA-cDNA杂交体。随后又在反转录酶的作用下，水解掉RNA链，再以cDNA为模板合成第二条DNA链。至此，完成由RNA指导的DNA合成过程。病毒复制方式：逆转录病毒（属于RNA病毒）：RNA→DNA→RNA。拟逆转录病毒（属于DNA病毒）：DNA→RNA→DNA。广州快速逆转录酶报价
