miRNA的加尾法逆转录和qPCR，miRNA加尾法逆转录：增加miRNA逆转录产物长度较直接的方法就是增加miRNA的长度，即在miRNA的3端后面添加一段序列，然后进行逆转录反应。因此，加尾法是由两个酶共同作用完成的，它们分别是PolyA聚合酶和逆转录酶。PolyA聚合酶负责给miRNA加上PolyA尾，增加其长度。之后逆转录引物结合到PolyA序列上，由逆转录酶完成加长版cDNA的合成。miRNA的加尾法逆转录和qPCR中的qPCR：miRNA荧光定量PCR的过程跟普通mRNA的相似，但由于加尾法逆转录产物的5端均为通用序列，因此其qPCR反向引物都是相同的(通用引物R)，不同的是根据miRNA序列设计的正向引物。正向引物的特异性就变得非常重要。对于内参，生工生物的miRNA加尾法首先链cDNA合成试剂盒(B532451)中内置了内参U6的正向引物，使用该引物与通用引物R即可进行内参U6的扩增。逆转录实验过程需适当的RNA质量，过少或质量不佳将影响扩增效果。深圳一体化逆转录试剂研发
逆转录实验的准备工作：1、实验器具与材料：（1）移液头：200ul、10ul；（2）吸头：200ul、20ul；（3）EP管1。5ml、100ul；（4）水浴箱。2、实验器具的处理与准备，塑料制品：（包括吸头、EP管等）将塑料制品逐个浸泡于1‰DEPC水中（必要时小头头需要用吸管打入DEPC水）37℃过夜，然后送至高压3次，后在80℃烘烤箱中烘干（或置于37℃中8小时左右烘干），试验前将头头放入吸头台。3、试剂配制和准备：（1）DEPC水：泡实验器具的DEPC水的配制：1000ml双蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中静置4小时后备用。逆转录中所用的DEPC水的配制：100ml盐水瓶内装40ml双蒸水，加40ulDEPC，37℃过夜，送至高压，后分装到几个1。5mlEP管中，-20℃中保存备用。（2）RT中所需要的各种试剂。深圳一体化逆转录试剂研发逆转录实验完成反应后要及时保存和处理PCR产物，并记录实验数据和结果等。
逆转录常见问题及解决方法之RNA浓度不高：a)、原始组织样本或细胞量太少:提高加入量。b)、RNA发生降解:如果使用者确定提取RNA的试剂/器具没有问题，RNA的降解通常发生在样品破碎/匀浆阶段。有两个办法可以彻底抑制内源RNase活性:1.立即加入裂解液并且彻底而迅速地匀浆。这只适合培养细胞及内源RNase含量较低的并且较容易匀浆的组织，2.对于内源RNase含量高或不易匀浆的组织，如肝脏、胰腺、脾脏、肌肉等，或植物组织，需要切成小块后立即投入液氮冷冻，再按说明进行破碎/匀浆。c)、加入异丙醇后室温沉淀10min或-20C冰沉淀30min即可，无需过夜沉淀。
逆转录实验过程中要注意RNA样品的保存、纯化、处理和转录酶的选择，逆转录实验前要对反应体系进行无RNA和无反转录酶的对照。多逆转录酶都具有多种酶活性，主要包括以下几种活性。①RNA指导的DNA聚合酶活性；以RNA为模板，催化dNTP聚合成DNA的过程。此酶需要RNA为引物，多为色氨酸的tRNA，在引物tRNA3′－末端以5′→3′方向合成DNA。反转录酶中不具有3′→5′外切酶活性，因此没有校正功能，所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较高。②RNaseH活性；由反转录酶催化合成的cDNA与模板RNA形成的杂交分子，将由RNaseH从RNA5′端水解掉RNA分子。逆转录的反应机理是RNA模板上的DNA合成。
逆转录酶还有DNA内切酶活性，这可能与病毒基因整合到宿主细胞染色体DNA中有关。逆转录酶的发现对于遗传工程技术起了很大的推动作用，它已成为一种重要的工具酶。用组织细胞提取mRNA并以它为模板，在逆转录酶的作用下，合成出互补的cDNA，由此可构建出cDNA文库（cDNAlibrary），从中筛选特异的目的基因，这是在基因工程技术中较常用的获得目的基因的方法。简要过程表示：逆转录酶的作用是以dNTP为底物，以RNA为模板，tRNA(主要是色氨酸tRNA)为引物，在tRNA3'-末端上，按5'→3'方向，合成一条与RNA模板互补的cDNA单链，它与RNA模板形成RNA-cDNA杂交体。随后又在反转录酶的作用下，水解掉RNA链，再以cDNA为模板合成第二条DNA链。至此，完成由RNA指导的DNA合成过程。病毒复制方式：逆转录病毒（属于RNA病毒）：RNA→DNA→RNA。拟逆转录病毒（属于DNA病毒）：DNA→RNA→DNA。逆转录实验中的RNA样品处理时要避免使用酸性物质、有机溶剂和酶切酶剂。深圳一体化逆转录试剂研发
逆转录在病毒学、免疫学等领域有普遍的应用。深圳一体化逆转录试剂研发
miRNA加尾法及其逆转录是近年来普遍用于miRNA研究的一种技术。它可以帮助我们深入理解miRNA的调控机制，它质量得到改进，效率也得到提高从而为miRNA研究提供了非常重要的资源。未来,miRNA加尾法及其逆转录一定会成为miRNA研究的重要部分，为miRNA研究提供更多有价值的信息。逆转录是一种重要的生物学现象，它在病毒的复制过程中发挥着重要的作用。同时，逆转录还可以作为基因的调节机制，从而控制基因的表达和功能。我们相信，在未来的研究中，逆转录的研究将会取得更多的进展，并且会为治着某些疾病提供更多的帮助。深圳一体化逆转录试剂研发
