RNA逆转录实验注意事项：去除基因组DNA污染：残留的基因组DNA(gDNA)会对荧光定量结果造成很大的干扰，为了使结果更加的真实、可重复，我们需要去除gDNA干扰。我们可以在引物设计时避免gDNA的扩增，比如将上下游引物分别设在不同的外显子上；或者在提取RNA后使用DNaseI处理以除去gDNA。较后，我们还有非常法宝，选择一款具有gDNA去除功能的逆转录试剂盒，一步到位去除gDNA，省心省力max。RNA逆转录实验注意事项：逆转录酶热稳定性：逆转录酶在整个反转录体系中具有关键性影响。除了活性以外，逆转录酶的热稳定性同样很重要，在较高温度下进行逆转录，能够减少RNA的二级结构，增加逆转录的效率。野生型的M-MLV逆转录酶很“怕热”，高于37℃时，稳定性大幅下降。逆转录实验时要记录反应体系的温度、时间、反应试剂的添加量等参数。武汉快速逆转录混合多少钱
逆转录酶的质量控制：1.切口酶：在与200单位酶37oC保温60分钟后，超螺旋质粒保留在90%以上。2.DNase测定：200单位酶与50ng3H-DNA37oC保温60分钟，分解出的放射性低于1%。3.RNase测定：200单位酶与50ng3H-RNA37oC保温60分钟，分解出的放射性低于3%。4.首先链cDNA的反应：在标准化的反应中，200单位酶催化从1mg1.2kbRNA或1mg7.5kbRNA将同位素掺入到cDNA中，通过放射自显影，对于1.2kb的RNA，产物cDNA是单一的、全长的条带。对于7.5kb的RNA产物有部分是全长的条带。用这二种RNA放射性转换到cDNA中有12%。5.RNaseH活性：200单位酶与polyA:polydT37oC保温60分钟，释放出的放射性要低于1%。反转录企业逆转录实验反应过程中需控制反应温度，时间和pH值等指标。
茎环法逆转录是一种逆转录反应的技术，它利用茎环结构的RNA分子作为反向引物，在逆转录过程中特异性地扩增目标RNA分子。该技术在分子生物学和医学研究中得到了普遍的应用，特别是在RNA的研究和检测中具有独特的优势。茎环法逆转录技术的基本原理是利用逆转录酶和茎环结构的RNA作为反向引物，将RNA逆转录成cDNA，并在PCR反应中扩增。茎环结构的RNA分子具有较高的稳定性和特异性，可以特异性地识别和结合目标RNA分子，从而在逆转录反应中作为反向引物扩增目标cDNA。此外，由于茎环结构的RNA分子与目标RNA分子的碱基序列互补，因此茎环法逆转录技术可以避免随机引物引起的非特异扩增。
RT-PCR逆转录中模板的选择：在RT-PCR实验中，选择总RNA或纯化的mRNA作为模板进行逆转录十分重要。mRNA虽然能提供略高的灵敏度，但总RNA经常使用，具有较mRNA更重要的优势。首先，其过程需要较少的纯化流程，这保证了更好的回收模板和更好的把结果标准化为起始的细胞数。第二，避免mRNA富集步骤，为了避免不同mRNA的回收率而带来结果偏移的可能性。总之，在大多数的应用中，目标基因的相对定量比检测的非常灵敏度更重要，因此在多数情况下，总RNA更适用。逆转录实验中可以通过qPCR检测逆转录反应效果。
逆转录酶的合成步骤：1、使用前每个组份轻轻混匀，然后2000rpm离心20s；2、取灭过菌且无核酸酶的0.2ml离心管，依次加入2～5μgRNAnμL；3、65℃保温5min，然后冰浴5min；4、往3步骤中的0.2ml离心管依次加入下列组份：RNase抑制剂（40u/μL）0.5μL、10×M-MLVReactionBuffer2μL、DTT（200mM）1μL、逆转录酶（M-MLV）1μL；5、轻轻混匀后，然后2000rpm离心20s；6、先在37℃保温1hr，然后70℃保温15min；7、上述产物可立即进行下一步的PCR反应或-20℃保存。逆转录酶的质量控制：物理纯度：在SDS－PAGE上>90%纯。储存缓冲液：20mMTris-HClpH7.5；200mMNaCl；0.1mMEDTA；1mMDTT；0.01%NP-40(一种去垢剂)和50%甘油。反应缓冲液：250mMTris-HClpH8.3；375mMKCl；15mMMgCl2；50mMDTT(以Part#M531A供应)。逆转录实验中的RNA样品处理时要避免使用酸性物质、有机溶剂和酶切酶剂。深圳cDNA合成反转录多少钱
逆转录实验过程中要注意RNA样品的保存、纯化、处理和转录酶的选择。武汉快速逆转录混合多少钱
miRNA的加尾法逆转录和qPCR，miRNA加尾法逆转录：增加miRNA逆转录产物长度较直接的方法就是增加miRNA的长度，即在miRNA的3端后面添加一段序列，然后进行逆转录反应。因此，加尾法是由两个酶共同作用完成的，它们分别是PolyA聚合酶和逆转录酶。PolyA聚合酶负责给miRNA加上PolyA尾，增加其长度。之后逆转录引物结合到PolyA序列上，由逆转录酶完成加长版cDNA的合成。miRNA的加尾法逆转录和qPCR中的qPCR：miRNA荧光定量PCR的过程跟普通mRNA的相似，但由于加尾法逆转录产物的5端均为通用序列，因此其qPCR反向引物都是相同的(通用引物R)，不同的是根据miRNA序列设计的正向引物。正向引物的特异性就变得非常重要。对于内参，生工生物的miRNA加尾法首先链cDNA合成试剂盒(B532451)中内置了内参U6的正向引物，使用该引物与通用引物R即可进行内参U6的扩增。武汉快速逆转录混合多少钱
