华南地区一体化数字PCR荧光通道

数字PCR技术流分类目前，dPCR的基本方法都已经建立，根据反应单元的不同形式，主要可分为微板式、微腔式和和微滴式三大类系统。微液滴制备的方法，目前主流的有四种：1）芯片微孔物理分割法，俗称物理分隔法，公司有Fluidgm，Qiagen，Roche，ThermoFisher，;2）液滴分割法，俗称油包水，代替公司有Bio-Rad;3）杂交式芯片液滴法，公司有Stilla;4）注射振动制滴法。PS：芯片式物理分割技术所有已经过期，目前有不少公司在这个技术的基础上进行开发，例如罗氏。数字PCR主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法。华南地区一体化数字PCR荧光通道

数字PCR技术是继一代普通PCR、二代荧光定量PCR之后的第三代PCR技术。该技术将一个样本分成几到几十万份，分配到不同的反应单元，每个单元包含一个或多个拷贝的目标分子(DNA模板)，在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增；扩增结束后，将有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，计算出待检靶分子的浓度或拷贝数。定量：不再依赖于Ct值和标准曲线，直接给出靶序列的起始浓度，实现真正意义上的定量。更高灵敏度与特异性：数字PCR可实现万分之一稀有样本的定量，可用于极微量核酸样本检测、复杂背景下的稀有突变检测、表达量微小差异鉴定、单细胞基因表达等方面。数字PCR在分子诊断领域将会发挥巨大的作用，数字PCR适用于生物标志物研究、拷贝数变异分析、微生物检测、转基因生物检测、mRNA和miRNA检测、基因相对表达研究等，并对遗传病、、产前诊断的研究提供了一种全新的技术思路与手段，具有广的、不可替代的应用前景。珠三角全自动多重数字PCR生命科学用品20世纪末，Bert Vogelstein等提出数字PCR的概念。

数字PCR技术的出现不是为了完全取代原有分子诊断技术，而是更好的补充和完善现有技术平台。数字PCR为不同应用场景下的多样化核酸检测需求提供了新的思路，尤其是在临床检测方面，在 性疾病早期检测、 疾病的伴随诊断、生殖遗传筛查等领域展现出良好的应用前景。国产数字PCR企业在商业化应用方面，也不断“攻城略地”。新羿生物在检测及 疾病伴随诊断方面开发了一系列试剂盒，并积极推进注册临床试验；领航基因聚焦在血流 （脓毒症）及呼吸道 领域，相继推出了多款病原菌检测试剂盒；锐讯生物聚焦于检测，2020年其产品获得FDA紧急授权。除此之外，在公共卫生领域，国产数字PCR企业针对食源性致病菌、鼠疫、虫媒病毒等，也推出多种检测试剂盒。

常规PCR和实时荧光PCR定量检测都需要已知拷贝数的标准DNA制定标准曲线，由于样品测定在各种条件上不会完全一致，会造成PCR扩增效率的差异，从而影响定量结果的准确性。而ddPCR不受标准曲线和扩增动力学影响，可以进行定量。如何在双通道设置及双探针标记的情况下实现多重检测?不同位点的双探针检测体系中引物和探针采用不同的终浓度，这样阳性微滴的终点FAM/HEX荧光信号强度就会不同，利用阳性微滴不同的“分簇(cluster)”来区分不同的突变位点。采用对应的KRAS野生型和突变型细胞系对双重ddPCR检测体系的性能进行验证。结果显示除了Q61H位点外，其他位点的检测体系在54C的情况下均能很好的区分4个明显的cluster。臻准推出新款数字PCR产品：AccuONE2.0数字PCR系统。

现有dPCR分析方法采用荧光探针和基于光的检测方法来鉴定扩增产物。这些方法要求足够的靶分子扩增以产生足以被检测到的信号，但可能会导致额外的错误或偏差，因此，希望能够提供一种改进的、用于检测样品内感兴趣的核酸的方法，其采用替代性分析方法，具有提高的准确度和精确度，并且其具有可以与基于dPCR的方法关联使用的灵敏度。dPCR还在样品内进行单一反应，但是所述样品被分离成大量的分区(partition)，并且所述反应在每个分区中单独进行。这种分离允许对核酸量进行灵敏的测量。DPCR已被证明可有效用于研究基因序列中的变异，例如拷贝数变异或点突变。数字以灵敏度和准确度测量突变的变异程度、检测稀有的DNA靶拷贝以及解析拷贝数变
异状态。广州一体化数字PCR原理

数字PCR作为研发阶段的验证方案之一。华南地区一体化数字PCR荧光通道

dPCR的结果统计方式有2种，一种是采用标记多种颜色，通过不同检测通道分辨不同颜色和强度，再根据分散液滴的数量计算待测基因的含量；另一种采用概率统计的数据处理方法，即通过泊松分布的方法对结果进行分析。应用概率统计分析数据和对数据处理方法的模型直接关系着结果的准确性和分析时间的长短。常用的统计方法是假设每个微反应单元的体积相同，根据泊松统计计算拷贝数，公式为：M=-Vx1n（1-x/）其中M是目标总拷贝数量；V是微反应单元数量；x是发光的微反应单元数量。华南地区一体化数字PCR荧光通道

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