心肌缺血再灌注损伤与线粒体自噬的关系可能存在以下几种机制:①发生心肌缺血再灌注损伤时,溶酶体膜蛋白2的表达受抑制,因此会阻碍线粒体自噬体与溶酶体的融合,从而抑制线粒体自噬;②心肌缺血再灌注损伤产生的ROS可促进Beclin表达,其与NIX/Bnips竞争性结合Bcl-2/Bcl-xL,从而抑制NIX/Bnip3介导的线粒体自噬,而在缺血梗死的心肌组织中,主要由NIX/Bnip3介导完成线粒体自噬。上述两种情况均会导致线粒体自噬水平降低,受损或功能障碍的线粒体堆积,影响细胞功能,进而导致细胞死亡。在一些病变发生的早期,促进自噬可能是一条可行的抗病变途径。吉林细胞自噬慢病毒
细胞经诱导或阻止后,需对自噬过程进行观察和检测,常用的策略和技术有:1、利用WesternBlot检测LC3-II/I比值的变化以评价自噬形成自噬形成时,胞浆型LC3(即LC3-I)会酶解掉一小段多肽,转变为(自噬体)膜型(即LC3-II),因此,LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。(注意:LC3抗体对LC3-II有更高的亲和力,会造成假阳性。方法2和3需结合使用,同时需考虑溶酶体活性的影响。)2、检测长寿蛋白的批量降解:非特异。3、MDC(Monodansylcadaverine,单丹磺酰尸胺)染色:包括自噬体,所有酸性液泡都被染色,故属于非特异性的。4、CellTrackerTMGreen染色:主要用于双染色,但其能染所有的液泡,故也是属于非特异性的。北京western blot检测自噬流自噬并不引发细胞死亡,相反促进细胞存活。
自噬(Autophagy),或称自体吞噬,是一个涉及到细胞自身结构通过溶酶体机制而被分解的过程,该过程是一个受到紧密调控的步骤,帮助细胞产物在合成、降解以及接下来的循环中保持一个平衡状态。细胞接受自噬诱导信号后,在胞浆的某处形成一个扁平的类似“脂质体”样的膜结构,称为Phagophore。随着Phagophore不断延伸,将胞浆中的细胞器等成分,全部包裹住成为密闭的结构,称为“自噬体(autophagosome)”。自噬体形成后,可与溶酶体融合,自噬体中的内容物随即被降解,产物(氨基酸、脂肪酸等)被输送到胞浆中,供细胞重新利用,而残渣或被排出细胞外或滞留在胞浆中。
汉黄芩苷是中药黄芩的有效成分之一,研究发现,在给予50、100、200、300、400 μmol/L的汉黄芩苷后,MDA-MB-231细胞活力有不同程度的降低;汉黄芩苷可引起MDA-MB-231细胞自噬,且具有时间和浓度依赖性,其调节细胞自噬的机制与MAPK-mTOR通路相关而非JNK通路。另外,从中药点地梅中分离得到的三萜皂苷类化合物saxifragifolin D(SD),增加MCF-7和MDA-MB-231细胞LC3-II、Beclin-1、III型PI3K(Vps34)蛋白的量,并通过活性氧(ROS)介导的内质网应激(ER stress)途径诱导乳腺ai细胞凋亡和自噬,抑制ai细胞的增殖。槲皮素、汉黄芩苷等可诱导细胞自噬,而β-细辛醚、丹酚酸B、人参皂苷Rg1则具有抑制细胞自噬的作用。
微管相关蛋白1轻链3(LC3/Atg8)是自噬体膜上的标记蛋白。细胞内存在两种形式的LC3蛋白,LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ。细胞内新合成的LC3其C端被Atg4蛋白酶剪切,成为胞质可溶形式的LC3-Ⅰ。当自噬体形成后,LC3-Ⅰ经剪切和泛素化加工修饰。与自噬体膜表面的磷脂酰乙醇胺(PE)偶联,成为膜结合形式的LC3-Ⅱ并定位于自噬体内膜和外膜,因此LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的大小可以估计自噬水平的高低。
除了LC3,自噬体膜上标志性蛋白质还有Atg12-Atg5结合体。Atg12和Atg5在翻译后就像单个分子一样共价结合在一起,它定位在自噬体双层隔离膜的整个延长阶段。 分子伴侣介导的自噬发生在许多组织中,主要功能有长期饥饿时为细胞供能,调节代谢通路,清理无用蛋白质等。安徽western blot检测自噬流
对神经退行性疾病来说, 活化自噬更多要考虑的是在适当的时间和适当的组织活化自噬流。吉林细胞自噬慢病毒
自噬过程的调控:自噬这一过程一旦启动,必须在度过危机后适时停止,否则,其非特异性捕获胞浆成分的特性将导致细胞发生不可逆的损伤。这也提醒我们在研究自噬时一定要动态观察,任何横断面的研究结果都不足以评价自噬的活性。目前,已经报告了许多因素能诱导细胞发生自噬,如饥饿、生长因子缺乏、微生物传染、细胞器损伤、蛋白质折叠错误或聚集、DNA损伤、放疗、化疗等等,这么多刺激信号如何传递的、哪些自噬蛋白接受信号、又有哪些自噬蛋白去执行等许多问题都还在等待进一步解答中。关于传递自噬信号的通路目前比较肯定的有:阻止类ClassIPI3Kpathway(PI-phosphatidylinositol,磷脂酰肌醇)与IRS(Insulinreceptorsubstrate)结合,接受胰岛素受体传来的信号(血糖水平高阻止自噬)。吉林细胞自噬慢病毒
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