逆转录实验过程中要注意RNA样品的保存、纯化、处理和转录酶的选择，逆转录实验前要对反应体系进行无RNA和无反转录酶的对照。多逆转录酶都具有多种酶活性，主要包括以下几种活性。①RNA指导的DNA聚合酶活性；以RNA为模板，催化dNTP聚合成DNA的过程。此酶需要RNA为引物，多为色氨酸的tRNA，在引物tRNA3′－末端以5′→3′方向合成DNA。反转录酶中不具有3′→5′外切酶活性，因此没有校正功能，所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较高。②RNaseH活性；由反转录酶催化合成的cDNA与模板RNA形成的杂交分子，将由RNaseH从RNA5′端水解掉RNA分子。逆转录的反应条件和反应体系的优化十分重要。昆明带gDNA Remover逆转录
逆转录过程是病毒的复制形式之一，如RNA病毒中的逆转录病毒，DNA病毒中的拟逆转录病毒的复制均需要经过逆转录。逆转录过程在真核细胞中也同样存在，例如逆转座子和端粒DNA的延长均存在逆转录过程，需逆转录酶的催化，端粒酶即为真核细胞中的逆转录酶。逆转录过程的揭示是分子生物学研究中的重大发现，是对中心法则的重要修正和补充。人们通过体外模拟该过程，以样本中提取的mRNA为模板，在逆转录酶的作用下，合成出互补的cDNA，构建cDNA文库，并从中筛选特异的目的基因。该方法已成为基因工程技术中较常用的获得目的基因的策略之一。武汉miQP2逆转录试剂研发逆转录是许多病毒复制中必不可少的步骤。
逆转录是指以RNA为模板合成DNA的过程，即将遗传信息由RNA逆向传给DNA的过程，其遗传的传递方向与转录相反。反转录酶也可写成逆转录酶又称为依赖RNA的DNA聚合酶。是以RNA为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNA（cDNA）的酶。哺乳类C型病毒的反转录酶和鼠类B型病毒的反转录酶都是一条多肽链。鸟类RNA病毒的反转录酶则由两上亚基结构。真核生物中也都分离出具有不同结构的反转录酶。RNA指导的DNA聚合酶活性；以RNA为模板，催化dNTP聚合成DNA的过程。此酶需要RNA为引物，多为色氨酸的tRNA，在引物tRNA3′－末端以5′→3′方向合成DNA。反转录酶中不具有3′→5′外切酶活性，因此没有校正功能，所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较高。
逆转录实验步骤：用SSⅢ逆转录酶进行RT（20ul体积）1、准备0、65ml的EP管。2、冰上操作：在EP管中加入10ulDEPC水，1ul引物，1ul模板RNA，1uldNTP，短暂离心。3、65℃水浴5分钟后，立刻0℃冰水浴至少1分钟。4、短暂离心后，冰上操作：加入4ul5×First-StrandBuffer，1ul0.1MDTT，1ulRNAseInhibitor，1ulSSⅢ逆转录酶。5、短暂离心。6、50℃水浴60分钟进行逆转录。7、70℃水浴15分钟灭活逆转录酶。8、－20℃保存，或立即进行PCR。MCERTmix含有比例优化的Oligo(dT)和RandomPrimers，使cDNA合成可从RNA转录本的各个区域起始，并具有相同的逆转录效率，较大程度保证qPCR结果的真实性和可重复性。逆转录PCR在检测病毒、诊断疾病等方面有普遍应用。
M-MLV反转录酶比AMV反转录酶缺乏连续性，因此要获得像AMV反转录酶反应中产生同样量的cDNA就要求使用较多单位的M-MLV反转录酶。用1微克的mRNA起始合成首先条链的cDNA，要用8单位的M-MLV反转录酶才相当于1单位的AMV反转录酶的作用。该酶很容易被亚精胺(Spermidine)所抑制，该酶非常不能用Promega的RiboprobeAMV反转录酶5X反应缓冲液，也不能用Promega的RiboclonecDNA首先条链缓冲液，因为这二种缓冲液均含有亚精胺。逆转录实验可以选择加入RNA合成抑制剂RNAse防止RNA降解和污染，逆转录实验过程需适当的RNA质量，过少或质量不佳将影响扩增效果。逆转录技术可以进行从RNA到DNA的转化，从而保护RNA序列的完整性。昆明带gDNA Remover逆转录
逆转录过程中的缺陷会导致错误扩增和偏差。昆明带gDNA Remover逆转录
逆转录常见问题及解决方法之组织提取：RNAisolater可以提取miRNA吗?可以提取miRNA。他普遍适用于培养细胞、动物组织、微生物以及代谢较少的植物组织，如幼苗、幼叶等。提取的RNA有基因组DNA污染：a)、向裂解液中加入氯仿后，需要在低温下(2-8°C)高速离心。离心后，RNA被抽提到上层的水相中，中、下层是有机相，含有氯仿。DNA即存在于中层。氯仿在常温下会与水以一定比例互溶，因此，常温离心会导致上层水相中也有少量基因组DNA污染。吸取上层液体时，应非常小心，避免吸到中间层和下层，为此失去一点得率，保留一些上清不吸是非常值得的。RNA应如何保存：建议分装后在-80℃长期保存，在-20℃可以短期保存，但需要尽快使用。昆明带gDNA Remover逆转录
