北京基因疗法脱靶检测安全性评价

目前鼓润已掌握了该项技术，简述如下：1、CRISPR与dsODNtag整合的实验技术及高通量测序建库流程将靶向于目标基因组位点的CRISPR质粒与dsODNtag以核电转的方式同时转染入真核细胞，CRISPR造成基因组双链断裂后，dsODNtag将整合入断点处，作为后续分析在靶与脱靶情况的标记。转染后3天收集细胞的DNA进行高通量建库。2、GUIDE-seq生信分析方法1）搭建了高通量测序的数据分析流程。2）利用该技术分析了CRISPR靶向编辑某细胞系基因的在靶与脱靶情况。其中一例样品的分析结果如图4所示：Sequencesofoff-targetsitesidentifiedbyGUIDE-seq.Theintendedtargetsequenceisshowninthetoplinewithcleavedsitesshownunderneathandwithmismatchestotheon-targetsiteshownandhighlightedincolor.GUIDE-seqsequencingreadcountsareshowntotherightofeachsite.3）利用PCR扩增技术联合Sanger测序鉴定了分析出的脱靶位点。脱靶检测评估，推荐唯可生物，实验实力强，专业性高，检测效率高，结果准确率高。北京基因疗法脱靶检测安全性评价

CRISPR基因编辑zhiliao发展如火如荼，但也有不少人对基因zhiliao的安全性提出担忧，由于CRISPR技术是直接改变基因组DNA，其中任何的改变都会被长久保留下来，所以CRISPR对于DNA序列的任何改变都需要严谨的安全评估。根据目前已经公开的FDA关于基因zhiliao的指导文件，对于基因zhiliao安全性的评估可以简单总结为两个方面：由于目前大部分CRISPR基因编辑zhiliao方案是基于CRISPR引起的DNA双链断裂和随机突变进行基因敲除，所以一类风险主要是指靶位点的随机突变引发的安全风险，如果出现大片段丢失、染色体重排等异常变化，都存在巨大的安全隐患。温州种子脱靶检测服务可以与靶基因之外的其他基因作用而非特异性阻断基因表达,即产生非靶基因的沉默效应。

基因编辑产品除了适用基因zhiliao产品的一般考虑以及整合性载体的特殊考虑外，长期随访中还应额外关注脱靶风险，量化评估脱靶活性和在靶活性之间的相关性，或利用在靶活性来预测脱靶活性的水平。在开发过程中应同时关注基因转导效率、脱靶效率、插入突变情况、目的基因在靶细胞中整合位点及表达。评估基因zhiliao产品整合进基因组的可能性，判断是否需要开展另外的遗传毒性研究，评估插入突变（插入位点、插入拷贝数等）引起的遗传毒性风险。需要关注脱靶编辑、转座子转座印迹引起的遗传毒性问题；鉴定/表征基因组整合位点。非临床研究是药物开发的重要环节之一。

Guide-seq原理图，Discover-seq细胞内的脱靶切割一般无法直接捕获，除了Guide-seq这种连接dsODN来间接记录脱靶位点的方法外，研究者们还想出一种蛋白介导的方法Discover-seq。由于DNA双链断裂后细胞会启动DNA修复机制，大量蛋白参与到断裂处的修复，所以研究者就对相关蛋白进行筛选，找到其中MRE11结合DNA的位点与DNA双链断裂的相关性比较好。DISCOVER-seq便是通过MRE11的CHIP-seq（染色质免疫共沉淀）来反映CRISPR的脱靶位点。。。。根据选择的sgRNA，通过生物信息学方法，对sgRNA进行脱靶分析。

    基因编辑脱靶检测方法：ChIP-seq：利用缺乏DNA切割活性的dCas9结合DNA的特性，进行全基因组范围的结合情况检测，以评估潜在的脱靶位点。IDLVcapture：基于非同源末端连接（NHEJ）的DNA修复过程，通过转染筛选基因的IDLV进行筛选，以确认脱靶位点。GUIDE-seq：利用双链DNA断裂（DSB）位点的非同源末端连接过程中可以连入双链DNA的特性，通过引入短双链寡核苷酸来标记CRISPR/Cas9切割的DSB，进而确定脱靶突变的位置。LAM-HTGTS：基于CRISPR/Cas9等造成的DSB可能导致染色质DNA的易位连接，通过检查这些易位连接位点来识别潜在的脱靶位点。BLESS/BLISS/End-seq/DSBCapture等：这些方法通过直接在DSB位点连入接头，捕获DSB位点，结合高通量测序技术进行脱靶位点检测。DISCOVER-seq：利用DNA修复因子（如MRE11）结合染色质免疫共沉淀和高通量测序的方法，捕获CRISPR/Cas9造成的DSB位点，进而鉴定潜在的脱靶位点。 脱靶检测政策，推荐唯可生物，实验实力强，专业性高，检测效率高，结果准确率高。高精度脱靶检测安评

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    常用的脱靶检测方法DISCOVER-Seq：使用混杂的gRNAs在小鼠体内比较测试，通过纯化的DNA鉴定推测的脱靶位点，并使用扩增子NGS进行详尽地验证。VIVO：一种目前常用的检测方法，使用纯化的DNA鉴定出推测的脱靶位点。Detect-seq：一种针对碱基编辑器（CBE）的体外脱靶检测技术，通过检测dU（尿嘧啶）的转变来评估脱靶效应。SAFETI：一种检测碱基编辑器体内脱靶效应的新方法，通过转基因小鼠系统性地评估基因编辑工具的安全性。全基因组测序（WGS）：对编辑物种的全基因组进行测序，与参考基因组进行比对，较全检测基因编辑导致的变异。 北京基因疗法脱靶检测安全性评价