北京cck8检测原理

CCK-8（CellCountingKit-8）细胞活性和增殖检测是医学研究中常用的实验技术，其原理是该试剂中含有WST-8，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazandye）。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。以下是CCK-8检测的具体步骤：细胞活性检测1.在96孔板中接种细胞悬液(100ml/孔)。将培养板放在培养箱预培养(在37℃，5%CO2的条件下)。CCK-8的英文全称是Cell Counting Kit-8，也就是进行细胞计数的一个盒子。北京cck8检测原理

、***浓度的确定需要做一个时间梯度，铺板和上述相同，只需把各个实验组改成各个作用时间就可以了。至于说***浓度的确定，网上有很多确认方法，个人建议以IC50值作为***浓度即可。计算方法，某园子里都有，就不在这里介绍了。

MTT作用之后，一定要小心吸走培养液，以免将孔内的紫色结晶吸走。有条件的实验室，这一步可以采用离心机将沉淀充分离心到孔底，防止被吸出。如果没有这种类型的离心机，可以在测量吸光度的时候，将酶联免疫的机器震荡时间调制5分钟，**起码可以保证沉淀充分溶解。 北京cck8检测原理CCK8细胞增值检测实验简介.

贴壁生长的时间我一般就直接让它贴壁长24h了，这个时间细胞已经贴壁完全，而且这样设置时间对自己安排实验时间也方便。没人愿意大半夜爬起来做实验吧。3、加药后的孵育时间，我的实验摸了3个时间，24h，48h，72h。然后根据数据的稳定性（RSD）、OD值的范围（1.0左右）这些来选择比较好的时间。太长了就没有必要了，细胞呆在孔里几天不换液结果可想而知了。4、CCK8试剂加入量，说明书中明确写出建议加入量为培养基体积的10%。这里有一个问题：假设我要孔内是200微升的体系，即细胞悬液+药液+CCK8=200微升呢，还是细胞悬液+药液=200微升，cck8不算在体系内呢。关于这一点文献报道不一致。本人**终采用的是后者。

用途：

***筛选、

细胞增殖测定、

细胞毒性测定、

**药敏试验等。

所需设备及仪器：

10ul，100-200ul及多通道移液器

酶标仪（带有450nm滤光片）

96孔培养板

二氧化碳培养箱

培养0.5-4小时:细胞种类不同，形成的Formazan的量也不一样。如果显色不够的话，可以继续培养，以确认比较好条件。特别是血液细胞形成的Formazan很少，需要较长的显色时间（5-6小时）。

测定450nm吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm。 在96孔板中接种细胞悬液（100μL/孔）。将培养板放在培养箱中预培养（37℃,5% CO2）.

细胞增殖-毒性检测1.在96孔板中配制100ml的细胞悬液。将培养板在培养箱预培养24小时(在37℃，5%CO2的条件下)。2.向培养板加入10ml不同浓度的待测物质。3.将培养板在培养箱孵育一段适当的时间(例如:6,12,24或48小时)。4.向每孔加入10mlCCK-8溶液(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响O.D值的读数)。5.将培养板在培养箱内孵育1-4小时。6.用酶标仪测定在450nm处的吸光度。7.如果暂时不测定O.D值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入10ml0.1MHCl溶液或者1%w/vSDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在24小时内吸光度不会发生变化。注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK-8之前更换新鲜培养基，去掉***的影响。当然***影响比较小的情况可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入***后的空白吸收即可。用酶标仪测定在450nm处的吸光度。北京cck8检测原理

细胞增殖与毒性检测实验方法及经验总结-CCK-8 法.北京cck8检测原理

特点不同1、CellCountingKit-8：灵敏度高，数据可靠，重现性好；操作简便，省时省力；水溶性，不需要换液，尤其适合于悬浮细胞；无需放射性同位素和有机溶剂，对细胞毒性低；适合于高通量***筛选。2、MTT法：特点是灵敏度高、经济。三、应用不同1、CellCountingKit-8：主要用途为***筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、**药敏试验。2、MTT法：***用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗*****筛选、细胞毒性试验以及**放射敏感性测定等。北京cck8检测原理